留歐博士後重複實驗失敗：對韓春雨技術有幾點疑惑
據澎湃新聞9月8日報道，河北科技大學韓春雨於8月8日更新了實驗操作細節，來自丹麥奧胡斯大學的蔡宇伽根據新舊版本，兩次試圖重複實驗，然而都以失敗告終。
近日，蔡宇伽向澎湃新聞分享了他的實驗過程，他表示願意實名聊聊他的困惑。9月7日，蔡宇伽把韓春雨課題組論文中關於Figure4（圖4）的疑惑，郵件給《自然-生物技術》的編輯。
《自然-生物技術》的主編Andrew Marshall回覆了蔡宇伽，感謝他對韓春雨課題組論文中圖4的關注，並對他根據論文進行重複實驗遭遇困難表示遺憾。Andrew Marshall表示，雜誌編輯們將會綜合他們收到的關於NgAgo實驗的其他材料，一起討論。
韓春雨/資料圖
蔡宇伽是來自中國的丹麥奧胡斯大學博士後，他先後師從Jacob Mikkelsen 和Soren Paludan教授，研究方向是開發基因治療相關技術，包括病毒載體、基因編輯工具以及利用基因編輯工具研究免疫學問題，曾以第一作者身份在《eLIFE》期刊發表兩篇論文。
NgAgo技術是一門嶄新的基因編輯技術，由河北科技大學副教授韓春雨課題組5月2日在《自然-生物技術》上發表。NgAgo是“Natronobacterium gregoryi Argonaute”的簡稱，也就是來自格氏嗜鹽鹼桿菌的核酸內切酶。它不同於Argonaute（Ago）家族諸多需要高温的酶，能在37攝氏度常温下進行操作。這使得它能夠和當今最為時興的“基因魔剪”CRISPR-CAS9一起，共同效力於“編輯”目標基因，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。論文發表4個多月後，因多個實驗室表示無法重複實驗，NgAgo技術受到質疑。
兩次嘗試重複實驗失敗，蔡宇伽説，“這是我個人的例子，但是不能證明這個不能重複，還需要更多的人做實驗，公開數據。”他還提到：“科學家是有義務去公開數據，讓別人去重複。我個人認為，科學是站在別人的肩膀上，同時你也要願意成為別人肩膀，這樣科學才能進步。”
蔡宇伽第一次重複NgAgo實驗，是在韓春雨將實驗所需的質粒上傳到非營利性質粒共享信息庫Addgene後不久，蔡宇伽在一個基因上嘗試了NgAgo系統，沒有成功。
第二次，根據韓春雨8月8日上傳的新版實驗方法，在人類細胞上，蔡宇伽“完整”、“嚴格”地按照實驗方法來做，“我不能保證條件是完全一樣的，是按實驗室條件最大程度地接近”。在蔡宇伽使用了兩種不同的轉染方法（Lipofectamine 2000和鈣磷法）後，結果是“都沒有看到NgAgo有活性，而CRISPR都是有效的。”在科學網的博客上，蔡宇伽分享了自己第二次重複實驗時的T7EI結果圖。
蔡宇伽第二次嘗試重複實驗的T7EI結果圖。來源：蔡宇伽博客
值得一提的是，蔡宇伽公佈的實驗結果和相關數據，是為數不多針對韓春雨新版實驗方法而做出的。8月17日，日本東京都醫學科學研究所（Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science）PI（項目負責人）Yuichiro Miyaoka和澳大利亞科學家蓋坦·布爾焦都在個人推特上公佈了自己最新的實驗結論——無法重複。但Yuichiro Miyaoka和蓋坦·布爾焦都告訴澎湃新聞，他們的結果是根據韓春雨在《自然-生物技術》上的實驗操作進行，並非是更新的版本。
對於實驗所需的時間，蔡宇伽説最關鍵的實驗所需要的時間是5天左右。此前，韓春雨曾對質疑聲在論文發表後不到一個月就出現表示過疑問，他認為一個月“實驗還沒做完一輪”。進行過重複實驗但未成功的蓋坦·布爾焦和德國癌症研究中心的博士生Jan Winter都分別向澎湃新聞透露做完一次完整的NgAgo實驗所需的時間，蓋坦·布爾焦表示至少需要2-3個月，Jan Winter則表示，就他而言，全職做實驗無需耗費一個月時間。澎湃新聞向蔡宇伽詢問，為何蓋坦·布爾焦所需時間較長，蔡宇伽認為，這是因為蓋坦·布爾焦是在受精卵上做實驗，要“複雜一點”。
韓春雨曾表示，80%的NgAgo重複實驗失敗是因為污染。為了確認自己的實驗沒有污染，蔡宇伽把自己實驗所用的細胞送到德國GATC公司檢測是否有支原體污染，檢測結果顯示細胞是乾淨的。
蔡宇伽把細胞送檢德國GATC公司後的結果。來源：蔡宇伽博客
“他新的protocol主要是強調幾點：1.EDTA會影響NgAgo的活性。2.鎂離子有輔助作用，會幫助NgAgo保持活性。3.保證沒有污染。”蔡宇伽解釋説，他的重複實驗排除了EDTA和支原體污染，但仍不成功，也有可能是有一些其他不確定因素。在科學網的博客上，蔡宇伽分析這些不確定因素包括：“用的是實驗室現有的DNAase/RNAase-free的水，不確定PH是多少；也沒有熒光標記的ssDNA，不知道gDNA轉染效率怎樣；也沒有來得及用Fragment analyzer看看的gDNA的純度怎樣。”
蔡宇伽還透露説，重複不出的並不只是自己，“我們那個系，也有人重複了，用他們合成的NgAgo，試了韓的以及除了韓之外的方法，還試了各種方法，比如轉染，還把NgAgo做成病毒，感染細胞，但是也沒有成功。”
但蔡宇伽也強調：“誰也沒法説這是真是假。我個人是做了重複實驗，但是沒有重複出來。如果有忽視的地方，也完全有可能。但至少説明，NgAgo沒有那麼好做。”
儘管韓春雨本人也多次公開表示，目前的NgAgo尚不穩定，有不完善的地方，但蔡宇伽的困惑是，韓春雨發表在《自然-生物技術》的論文中説，NgAgo和CRISPR-Cas9一樣高效。
據澎湃新聞查閲發現，韓春雨論文原文中寫道：“NgAgo-gDNA 和Cas9-sgRNA在切割哺乳動物基因組DYRK1A位點的效率上是可以媲美的，NgAgo是31.97%，Cas9是32.2%（原文：NgAgo-gDNA and Cas9-sgRNA cleaved this locus with comparable efficiencies（Fig. 4e, 31.97% for NgAgo vs. 32.2% for Cas9））。”
“《Nature》的要求比較高，效率越高越好，這可能導致一些研究者做一些誇大。”蔡宇伽説。
蔡宇伽研讀過韓春雨課題組發表在《自然-生物技術》上的論文，他還表達了一些困惑。
首先是被認為最有難度、也最關鍵的Figure4（圖四），蔡宇伽説“我個人認為，圖有點自我矛盾。”他找出電腦中已經下載好的論文，一一指給澎湃新聞：“Fig.4a各靶點之間最大相隔30個核苷酸，T7EI切割，跑膠之後，各產物條帶大小一致。而在Fig.4e，Cas9靶點和NgAgo靶點部分重合，相距小於30個核苷酸，但卻看到了兩者產物條帶的明顯偏移。另一個奇怪的地方是，Fig.4e裏NgAgo兩個產物條帶分別小於對應的Cas9產物，而在Fig.4f裏NgAgo的兩個產物條帶大小卻和對應的Cas9產物一致。”
“另外一個比較困惑的地方，根據補充材料Supplementary table 2,GATA4基因的PCR擴增產物應該是705bp，而在fig.4f卻是稍大於750bp。” 蔡宇伽補充道。（記者/王盈穎）
韓春雨課題組論文中的Figure4。來源：韓春雨課題組論文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》。