氮高效轉基因水稻對土壤氨氧化細菌羣落多樣性的影響_風聞

**【導讀】**很多人對我國是否做過轉基因相關實驗，以及這些實驗到底是怎麼進行的幾乎沒有瞭解，對於反轉人士網傳的掛着“某某論文”頭銜的偽信息無從分辨。一個涉及轉基因水稻對環境影響的論文到底應該怎麼做呢？一個高質量，有説服力的論文到底是怎麼樣的？我們拿出一個案例來展示一下。

論文來源：《農業環境科學學報》2017 年 06 期

論文作者：魏琳琳 楊殿林 侯萌瑤 倪土 李剛 修偉明 王慧 趙建寧

論文單位：農業部環境保護科研監測所，東北農業大學資源與環境學院

文章以氮高效轉基因水稻OsNRT 2.3b 兩個不同株系N-04 和N-08 為研究對象，以非轉基因親本日本晴（Nipp）為對照，在田間小區試驗條件下，設施氮和不施氮兩種處理，採用變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術，分析了氮高效轉基因水稻在生長期對土壤氨氧化細菌羣落多樣性的影響。

研究發現，**水稻土壤氨氧化細菌豐富度指數在各生長期內品種間均不存在顯著差異。**兩種處理條件下N-04 的土壤氨氧化細菌香農-威納指數僅在拔節期與Nipp 有顯著差異，其餘生育期均無顯著差異；在施氮條件下N-08 的土壤氨氧化細菌香農-威納指數在拔節期和抽穗揚花期與Nipp 存在顯著差異，不施氮條件下僅拔節期出現顯著差異。兩種處理條件下，N-04 的土壤氨氧化細菌均勻度指數與Nipp 相比整個生長期均無顯著差異，而N-08 在拔節期顯著低於Nipp。測序結果表明，施氮和不施氮處理下氮高效轉基因水稻（N-08 和N-04）與Nipp 相比土壤中擁有更多的亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）。

研究表明，氮高效轉基因水稻在個別生育期對香農-威納指數和均勻度指數有顯著差異，且其更有利於促進土壤銨態氮向硝態氮的轉化。

前言

從1996 年到2015 年，全球轉基因作物累計種植面積達到空前的20 億hm2，轉基因作物已經成為現代農業史上推廣最為迅速的農作物，但轉基因作物在給人們帶來巨大經濟效益的同時，其所帶來的生態安全性問題也日益引起公眾的廣泛關注，尤其是對土壤微生物羣落多樣性的影響。有研究表明，轉基因棉花的種植能使土壤細菌和真菌的數量明顯增加，使其羣落組成發生變化，也有文獻報道轉基因作物的種植未對土壤微生物羣落結構產生顯著影響。然而，要更為深入評價轉基因植物對土壤微生物的影響，在研究分析整體微生物羣落的過程中，還應研究轉基因植物對土壤指示性微生物的影響。

氨氧化細菌作為微生物生態學研究的指示性微生物，同時也是執行硝化作用第一步（將氨氧化為亞硝酸鹽即硝化速率限制性步驟）的關鍵微生物，在土壤氮素循環中佔有重要地位，但其羣落組成容易受氣候條件、土壤利用方式和植被類型等的影響，因此受到相關領域科學家的廣泛關注。

氮高效轉基因水稻OsNRT 2.3b 是利用轉基因技術將水稻高親和硝酸鹽轉運蛋白OsNRT 2.3b 基因導入受體而獲得的超表達材料。Fan 等和唐仲研究發現，與常規稻相比，OsNRT 2.3b 超表達株系中積累的氮素總量提高了21%，銨態氮吸收速率提高了12%，氮素利用效率提高了40%，單株產量提高了30%。由於土壤氮循環長期處於一個動態平衡的狀態，氮高效轉基因水稻的種植勢必會從土壤中吸收更多的氮素，改變土壤氮素動態特徵，進而可能影響土壤氨氧化細菌羣落結構。

本研究採用PCR-DGGE 技術，以氮高效轉基因水稻OsNRT2.3b 的兩個不同株系N-04 和N-08 為對象，研究其土壤氨氧化細菌16S rDNA 基因羣落結構及多樣性組成，為科學評價氮高效轉基因水稻對土壤微生物的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗地概況與試驗設計

試驗在農業部環境保護科研監測所網室內進行，種植小區四周及底部為混凝土結構，內部長、寬、高均為1 m，小區內土壤為天津市津南區未種植過作物的潮土，全磷含量1.19 g·kg-1，全氮含量0.96 g·kg-1，有機質含量24.55 g·kg-1，pH 8.21。

試驗採用完全隨機區組設計，設施氮和不施氮兩種處理，5 次重複。氮源（20 g·m-2）為尿素[CO（NH2）2]，其中50%用作基肥，50%作追肥，追肥在水稻分櫱後期施用。分別以磷酸二氫鉀（P2O5：15 g·m-2）和硫酸鉀（K2O：18 g·m-2）作為磷肥和鉀肥，全部用作基肥。

1.2供試材料

試驗所用水稻為氮高效轉基因水稻OsNRT 2.3b的兩個不同株系N-04 和N-08 及非轉基因親本日本晴Nipp，均由南京農業大學資源與環境科學學院植物營養分子生物學實驗室提供。水稻種子於2015 年5 月8 日播種於培養盤中，每穴5 粒，於6 月25 日移苗，挑選長勢一致的水稻苗，每個小區內移栽水稻20 株。

1.3土壤樣品採集

分別於水稻分櫱期（7 月27 日）、拔節期（9 月8 日）、抽穗揚花期（10 月10 日）和成熟期（11 月12 日）採集土樣。採集土樣時，去除表面雜草和枯枝落葉，用直徑3.5 cm 的土鑽在距水稻主莖2 cm 處取20 cm 深的土樣，每小區3 個取樣點。將各個小區的樣品分別混合，置於-20 ℃冰箱，用於土壤氨氧化細菌羣落多樣性分析。

1.4測定方法

1.4.1土壤微生物總DNA 提取

本研究採用Mo Bio 公司的Powerlyzer powersoil DNA isolation kit（Mo Bio laboratories，Solana Beach，CA，USA）試劑盒，取0.5 g 鮮土置於Glass Bead Tube 中，按操作説明逐步進行提取，將提取到土壤的DNA 用1.5%的瓊脂糖凝膠檢測樣品質量，並於-20 ℃保存。

1.4.2PCR 擴增

採用巢式PCR（Nested PCR）方法擴增氨氧化細菌16S rDNA 基因序列，引物及反應條件見表1。第一輪PCR 反應產物大小為465 bp，PCR 反應體系為50 μL（兩種引物各0.5 μL，Premix Ex Taq 25 μL，稀釋2 倍的土壤DNA 模板5 μL，用滅菌水補足至50 μL）；第二輪PCR 反應產物大小為250 bp，PCR 反應體系為50 μL（兩種引物各0.5 μL，Premix Ex Taq 25 μL，第一輪PCR 產物5 μL，用滅菌水補足至50 μL）。

1.4.3變形梯度凝膠電泳（DGGE）檢測及條帶回收

PCR 產物採用Bio-Rad 公司的DcodeTM 通用突變檢測系統（Bio-Rad，USA），按照操作説明進行檢測。主要步驟如下：濃度為8%的聚丙烯酰胺，變性梯度為40%~60%（100%變性劑含有7 mol·L-1 尿素和40%（V/V）去離子甲酰胺），60 ℃預熱，將30 μL PCR 產物（與loading buffer 預混好）加入膠孔，先在60 ℃、60 V 恆定電壓下預跑30 min，然後在60 ℃、150 V 電泳6 h。電泳完畢後用SYBR Green Ⅰ（1∶10 000）染色30 min，再用Gel Dox XR 凝膠成像系統（Bio-Rad）進行觀察與拍照，選取主要條帶割膠回收。

1.4.4條帶純化克隆及測序比對

回收後的條帶用不帶GC 夾子的338f 和518r 引物進行擴增，PCR 產物經過電泳分析確定為單一條帶後，採用Wizad R SV Gel and PCR Clean-Up system 試劑（Progema，USA）純化，並與載體pGEM -T EasyVector（Progema，USA）連接轉化（4 ℃培養8 h），挑取培養後的白色菌落接種到LB 液體培養基中，37 ℃搖牀培養8 h，陽性克隆送出測序。測序結果在NCBI 上經Blast 比對分析，獲得相近典型菌株序列。

1.5數據分析

採用SAS 9.1.3（Tukey′s test）對試驗數據進行分析，Quantity One 4.6.2 軟件進行數字化處理並進行聚類分析。土壤氨氧化細菌16S rDNA 基因多樣性採用香農-威納指數（Shannon-Wiener index，H）、均勻度（Evenness index，En）和豐富度（Richness，S）來評價，其計算公式如下：

H=-ΣPi lnPi

En=H/lnS

式中：H 代表香農-威納指數；Pi 代表第i 條帶佔總強度的比值；En 代表均勻度指數；S 代表豐富度指數。

2 結果與分析

2.1土壤氨氧化細菌16S rDNA 基因DGGE 圖譜分析

DGGE 結果表明，各生長期N-04、N-08 和Nipp 在施氮和不施氮處理條件下DGGE 指紋圖譜多為共有條帶，只有少部分屬於差異條帶。在施氮條件下（圖1），N-04 僅在拔節期與Nipp 有2 條差異條帶（1B-2 和1B-4）；N-08 在分櫱期、抽穗揚花期和成熟期與Nipp 有4 條差異條帶（1A-3 和1A-5；1C-4；1D-5）。

不施氮處理條件下（圖2），N-04 在分櫱期、抽穗揚花期和成熟期與Nipp 各有1 條差異條帶（2A-2；2C-5；2D-4）；N-08 在4 個生長期與Nipp 共有8 條差異條帶（2A-5 和2A-7；2B-1；2C-3、2C-4、2C-6 和2C-8；2D-6）。

2.2土壤氨氧化細菌16S rDNA 基因多樣性分析

根據DGGE 指紋圖譜中每條條帶的灰度比率，對種植N-04、N-08 和Nipp 的土壤氨氧化細菌16S rDNA 基因豐富度指數（S）、香農-威納指數（H）和均勻度指數（En）進行分析。結果發現，在施氮和不施氮條件下，N-04 和N-08 的土壤豐富度指數與Nipp 在各生長期內均未出現顯著差異（表2 和表3）。

施氮條件下，N-08 的土壤氨氧化細菌香農-威納指數在拔節期時顯著低於Nipp，而在抽穗揚花期顯著高於Nipp，N-04 的在分櫱期、拔節期和成熟期均未出現顯著差異，僅在抽穗揚花期顯著低於Nipp（表2）；不施氮條件下，N-08 的土壤氨氧化細菌香農-威納指數在分櫱期、抽穗揚花期和成熟期均未出現顯著差異，僅在拔節期顯著高於Nipp，N-04 除抽穗揚花期顯著低於Nipp 外，其餘各時期與Nipp 均無顯著差異（表3）。

在施氮和不施氮條件下，N-04 各生長期土壤氨氧化細菌均勻度指數與Nipp 均無顯著差異（表2）；N-08 僅在拔節期顯著低於Nipp，其餘生育期未與Nipp 產生顯著差異（表3）。

2.3土壤氨氧化細菌16S rDNA 基因測序結果及系統發育分析

根據土壤氨氧化細菌DGGE 指紋圖譜（圖1 和圖2）及條帶灰度比率值大小，在施氮條件下選取32 條條帶，不施氮條件下選取29 條條帶，進行克隆測序，並經NCBI 序列比對分析。結果發現各選取條帶與已知序列相似度均在96%~100%之間（表4 和表5），將測序獲得的基因序列與Genbank 其他相似序列對比，繪製系統發育樹並進行系統發育分析（圖3 和圖4）。

從系統發育樹可以看出，施氮處理條件下32 個陽性克隆和不施氮處理條件下29 個陽性克隆主要屬於不可培養β-變形菌綱（Uncultured beta proteobacterium）、亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.），其中N-08 的優勢屬為亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.），N-04 和Nipp 的優勢屬均為不可培養β-變形菌綱（Uncultured beta proteobacterium）。

根據土壤氨氧化細菌DGGE 指紋圖譜及條帶比對結果發現，在施氮處理條件下，各生長期內N-08 屬於β-變形菌門的亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.）的條帶共有6 條，屬於β-變形菌門的亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）的有3 條，N-04 屬於上述菌屬的條帶共有6 條，而Nipp 有5 條（表4）。不施氮條件下，N-08 屬於β-變形菌門的亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.）和亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）的條帶共有6 條，N-04 則有5 條，Nipp 僅有1 條屬於亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）的條帶，未發現屬於亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）的條帶，且該條帶屬於三種水稻品種共有條帶（表5）。由此可以看出，N-08 和N-04 屬於亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.）的條帶數量顯著高於Nipp。

3 討 論

目前關於轉基因水稻生態環境安全性評價的研究主要集中在基因漂移、靶標及非靶標生物的影響以及農業生態環境等方面。轉基因生物釋放後是否對土壤微生物產生影響，近年已成為研究熱點。陳麗華等研究發現抗真菌轉基因水稻秸稈降解對土壤細菌數量的影響不顯著，且轉基因土壤樣品與非轉基因土壤樣品中土壤細菌的豐富度、多樣性指數、均勻度指數均不存在顯著差異。但陳曉雯等卻發現轉Cry1Ac 基因和轉Cry1Ab 基因水稻在生長旺盛時期，土壤中細菌數量顯著高於非轉基因親本水稻，不過這種影響的持續時間較短。陳麗華等也證實了廣譜抗真菌蛋白轉基因水稻秸稈降解對土壤可培養真菌數和真菌羣落結構有影響，但所產生的影響是短暫的、不持續的。

本研究發現，N-08 的土壤氨氧化細菌香農-威納指數在施氮條件下的抽穗揚花期和不施氮條件下的拔節期均顯著高於Nipp，其餘時期無顯著差異。這與Jin 等的研究結果一致，其也發現轉基因大豆的土壤氨氧化細菌香農-威納指數僅在收穫期顯著增高。本研究還發現N-04 與Nipp 的土壤氨氧化細菌香農-威納指數在施氮和不施氮處理條件下均無顯著差異（除抽穗揚花期外），説明氮高效轉基因水稻本身對土壤氨氧化細菌的影響也是短暫的，但不同施肥處理、不同生長期之間土壤氨氧化細菌香農-威納指數差異較大。這與金凌波等對轉基因大豆土壤微生物羣落水平的研究結果相似。Heuer 等對轉T4 溶菌酶基因土豆根際微生物羣落結構的研究，也發現其主要與季節、種植地點和年份有關。

本文對土壤氨氧化細菌均勻度指數的研究發現，在兩種供氮處理條件下，N-08 與Nipp 的土壤氨氧化細菌均勻度指數在分櫱期、抽穗揚花期和成熟期均無顯著差異，僅在拔節期顯著低於Nipp。邵婧鑫、徐廣惠也證明了這一現象，其發現轉基因大豆的土壤氨氧化細菌均勻度指數僅在生長旺盛時期顯著低於非轉基因品種。董蓮華等的研究也發現，轉Bt+CpTI 基因抗蟲棉的土壤氨氧化細菌均勻度指數在花鈴期顯著低於非轉基因材料，且其餘時期均未發現明顯差異，與本研究結果也一致，説明氮高效轉基因水稻對土壤氨氧化細菌均勻度指數的影響是短暫的。

亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.）在硝化作用第一階段亞硝化作用中起主導作用，可以促進NH4+ 氧化成NO2-，具有限制二氧化碳固定的能力，亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）可作為硝化細菌，將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽。本研究中施氮和不施氮處理下，氮高效轉基因水稻（N-04 和N-08）土壤中屬於亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.）的氨氧化細菌顯著多於Nipp。因此，N-04 和N-08 的種植存在促進土壤中銨態氮氧化為硝態氮的可能。本研究對各生長期土壤硝態氮和銨態氮含量也進行了分析（研究結果未在文中列出），結果發現N-08 和N-04 在生長旺盛時期土壤硝態氮含量確實顯著高於Nipp，而銨態氮含量顯著低於Nipp，也進一步證明了氮高效轉基因水稻的種植有利於土壤銨態氮向硝態氮的轉化。

4 結 論

（1）各生長期內氮高效轉基因水稻（N-04 和N-08）和非轉基因水稻（Nipp）在施氮和不施氮處理條件下DGGE 指紋圖譜多為共有條帶。

（2）N-04 和N-08 的土壤氨氧化細菌香農-威納指數和均勻度指數僅在個別時期與Nipp 產生顯著差異，説明氮高效轉基因水稻本身對土壤氨氧化細菌羣落多樣性的影響是短暫的。

（3）氮高效轉基因水稻（N-04 和N-08）土壤中屬於亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira sp.）和亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas sp.）的氨氧化細菌顯著多於Nipp，説明氮高效轉基因水稻的種植有利於土壤銨態氮向硝態氮的轉化。

參考資料略