西尼羅病毒研究進展_風聞

西尼羅病毒研究進展

老敗 2004****於上海

摘要

1999年夏季西尼羅病毒腦炎在美國的暴發流行引起美國社會和科學界的極大關注，儘管投入大量人力物力加以控制，在隨後幾年裏病毒感染的蔓延卻呈愈演愈烈之勢，並在2003年達到高峯，當年有9858人被診斷為西尼羅病毒感染，其中2866人出現中樞神經系統侵犯症狀，死亡264人。2004年情況有所緩解，截止至10月26日，感染2231人，其中795人出現中樞神經系統侵犯症狀，死亡73人。西尼羅病毒腦炎尚未傳入我國，但其對我國人民健康和公共衞生系統的潛在威脅與挑戰不容忽視。 本文就近幾年來對西尼羅病毒的感染、免疫與流行病學方面的研究進展進行綜述。

西尼羅病毒（West Nile Virus，WNV）於1937年從烏干達西尼羅地區的一位女性發熱患者體內被首次分離而得名。在其後的近三十年裏，西尼羅病毒感染導致的以發熱為主要症狀的傳染性疾病 - 西尼羅熱在非洲廣為流行，但沒有引起任何關注，具諷刺意味的是，歷史記載中首次西尼羅病毒導致的腦炎並非天災，而是人禍。1952年，美國紐約的Sloan-Kettering研究所為95位晚期癌症病人注射了西尼羅病毒以尋求其“溶癌”療效。其結果是9位病人因此感染腦炎。首例自然感染導致的西尼羅病毒腦炎發生於上世紀五十年代的以色列，隨後在1962至1963年小規模流行於法國，在其後的三十年中逐漸蔓延至環地中海以至歐洲各國，向東達到印度和中亞地區。其中，較大規模的暴發流行有1996年在羅馬尼亞、1999年在俄羅斯和2000年在以色列。這幾次暴發都達到患者數百人，死亡數十人的規模。

分子病毒學

西尼羅病毒屬於黃病毒科，黃病毒屬。目前已知70多種同屬病毒，其中約有半數可導致節肢動物傳播的人類疾病，廣為人知的有黃熱病、登革熱、日本腦炎等。在傳統病毒分類學中，此屬病毒被歸類於披膜病毒科（Togaviridae），但是，分子病毒學研究表明，此屬病毒在基因組、病毒結構、病毒複製機理等方面與披膜病毒都不相同，故於1985年被重新劃分為黃病毒科。

西尼羅病毒有着與同屬其它黃病毒相似的病毒結構、基因組組織結構和複製機制。其病毒顆粒直徑約40 – 60 nm，有宿主來源的脂蛋白包膜，包膜內的病毒核衣殼為對稱多面體狀，直徑約30nm。病毒包膜對維持病毒體結構的穩定性和保護病毒基因組有重要作用，因而病毒很容易被有機溶劑和去污劑滅活。病毒顆粒中包括3種結構蛋白，C（capsid）蛋白，E（envelope）蛋白和M (membrane) 蛋白。

C蛋白通過位於N、C兩端的氨基酸與病毒基因組RNA形成核蛋白複合物。其中段具疏水性，易於與細胞中的膜結構發生相互作用而與病毒的組裝有關。

E蛋白是一種糖蛋白，是病毒體表面的重要成分，具有血凝活性和中和抗原性。E蛋白有12個完全保守的半胱氨酸殘基，可形成6對二硫鍵。X線晶體衍射實驗表明，E蛋白以“頭尾相連”的同型二聚體存在於病毒表面。E蛋白被認為是宿主細胞表面受體的配體並介導病毒對細胞的粘附，實驗證據表明，當E蛋白中潛在的integrin聯結位點“天門冬氨酸-甘氨酸-精氨酸”結構被突變時，病毒進入宿主細胞的能力會被減弱。

M蛋白來源於其前體蛋白prM。當prM的N端，“pr”片段，被宿主來源的蛋白酶切除並釋放到胞外後，剩餘部分即為成熟M蛋白。M蛋白的具體功能尚不清楚，據推測與病毒的成熟與毒力有關。

西尼羅病毒的遺傳信息載體為一條線形正、單鏈RNA，長度約11kb。病毒基因組RNA在5＇端 有一個I型帽狀結構（m7GpppAmp），3＇端缺少聚腺苷酸序列，以CU-OH結尾。病毒基因組RNA可以直接作為mRNA，從一個開放閲讀框內翻譯出一條長鏈前體蛋白，在宿主細胞蛋白酶和一種病毒基因編碼的絲蛋白酶作用下，長鏈前體蛋白被切割成至少十種成熟的蛋白，其中包括3種結構蛋白（C、prM 和E蛋白）與7種非結構蛋白。這些蛋白在病毒基因組上的編碼順序為：C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5。 病毒的7種非結構蛋白功能尚不完全清楚。目前已知NS1是一種分泌蛋白並強烈激活宿主的體液免疫應答。用純化的NS1蛋白免疫動物可得到保護性免疫。NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS4B都是疏水性蛋白，據推測，它們有些是蛋白酶或蛋白酶輔助因子。NS3和NS5都是較大的親水性蛋白。NS3蛋白的N端1/3在氨基酸序列水平類似於一種胰島素樣絲氨酸蛋白酶，其酶活性已被實驗證實。NS3蛋白的C端3/4表現RNA螺旋酶活性，被認為與病毒RNA複製有關。與其他非結構蛋白比較，NS5蛋白在各種黃病毒中最為保守並具有兩種酶活性，即RNA依賴的RNA合成酶活性和甲基轉移酶活性。這兩種酶活性在病毒基因組複製過程中都起着重要作用。

黃病毒對宿主細胞的粘附和隨後的內吞都是由病毒E蛋白與細胞表面受體的相互作用介導的。然而，目前還沒有明確的受體分子被發現。另一種病毒對細胞的粘附方式被稱為antibody-dependent enhancement (ADE), 體外研究中發現，亞中和劑量的抗體通過其調理素作用，可以增強病毒對Fc表面受體陽性細胞的粘附。據推測，ADE對病毒的組織嗜向性和致病性都有一定影響。病毒借受體介導的內吞作用以吞噬小體的形式進入細胞後，在吞噬小體內酸性環境的作用下，病毒包膜與吞噬小體膜融合，病毒核衣殼被釋放入胞漿。在宿主細胞胞漿內完成前述的蛋白合成後，病毒來源的RNA複製酶開始病毒基因組RNA的複製。病毒RNA的複製主要發生於核周區。首先，以病毒正鏈RNA為模版合成全長的負鏈病毒RNA，這一過程在感染後三小時即可發生。隨後，負鏈病毒RNA即可以作為模版合成子代病毒正鏈RNA。病毒正鏈、負鏈RNA的合成是非對稱性的，其正鏈RNA的合成較負鏈RNA多十倍。子代病毒RNA合成後，於內質網內腔組裝新的病毒並由胞吐作用分泌到胞外，完成病毒繁殖週期。

西尼羅病毒可以在多種體外培養體系中生長，包括雞、鴨胚、各種人、猴、豬、齧齒類動物和昆蟲來源的細胞系並導致細胞病變效應。小鼠與豚鼠動物模型對病毒腦內注射感染高度敏感。病毒RNA具感染活性。

感染與免疫

流行病學調查表明，約80%的西尼羅病毒感染者並無症狀，另20%以發熱為主要症狀。其他的常見症狀有頭痛，極度乏力，噁心、嘔吐，皮疹，淋巴結炎。如果沒有嚴重併發症發生，以上症狀通常在一星期左右自愈，但乏力症狀通常延續更久。中樞神經系統感染多發於老年人，主要為為腦脊膜炎和大腦炎，是西尼羅病毒感染最嚴重的併發症，常表現為急性的軟癱。值得注意的是，西尼羅病毒中樞神經系統感染在感染人羣中的比例似有上升趨勢。如前所述，從三十年代病毒被發現到五十年代均無西尼羅病毒自然感染導致腦炎的報道。從五十年代到九十年代末期，出現中樞神經系統症狀的患者佔西尼羅病毒感染病例總數（出現臨牀症狀者）的1%左右。然而，最近的資料表明，這一比例在2003、2004年美國的流行中已接近三分之一。另一方面，某些其它症狀，如皮疹和淋巴結炎的發生率，在近期感染病人中顯著減少。這些現象表明病毒的變異在近期的爆發流行中起顯著作用。病毒對中樞神經系統的破壞被認為是病毒對神經元的直接侵染與宿主細胞毒性免疫反應共同作用的結果。至於病毒是如何突破血腦屏障的，目前尚無定論，一個假説是病毒可沿軸突逆行侵犯中樞神經系統。另外，已觀察到病毒可在血管內皮細胞中複製，是為病毒突破血腦屏障的又一個可能途徑。

西尼羅病毒感染沒有特異性症狀和體徵，常規實驗室診斷和醫學影像學診斷對鑑別診斷亦無重要幫助，確切的診斷只能依賴於血清學診斷和病毒分離。然而，西尼羅病毒與其同屬的黃病毒，即日本腦炎病毒，聖路易腦炎病毒，墨累谷腦炎病毒，Kunjun病毒共同形成一個血清族，它們之間存在着廣泛地抗原-抗體交叉反應，成為準確的血清學診斷的障礙。故此，在診斷工作中除應確保使用病毒特異性抗體外，最好還能使用一系列同屬病毒的抗體作為對照。目前，對西尼羅病毒腦炎還沒有有效的抗病毒治療，支持療法是僅有的治療手段。其病死率約為10%，而生存下來的病人中多有長期的神經、精神症狀後遺症。

前面提到過日本腦炎病毒與西尼羅病毒在生物分類和血清學方面的近似性。並且，多年以前，人們就在豚鼠中觀察到過日本腦炎病毒與西尼羅病毒的交叉保護反應。但是，最近的研究表明，由日本腦炎疫苗免疫的志願者的血清中並無西尼羅病毒中和抗體。迄今為止，只有一種西尼羅病毒滅活疫苗通過應急程序獲得批准在動物（馬）中使用。數種人用疫苗還處於研發階段。

流行病學

由於缺乏有效的疫苗和抗病毒藥物以預防和治療西尼羅病毒的感染。因此，瞭解病毒的傳播方式以切斷其傳播途徑成為人類對抗西尼羅病毒感染最主要的手段。與其他致病性黃病毒一樣，西尼羅病毒最主要的傳播者是蚊子。1999年在美國的研究顯示，庫蚊是西尼羅病毒的主要攜帶者。然而，2003年的研究表明西尼羅病毒已經可以從幾乎所有的蚊子種屬中檢出。鳥類是西尼羅病毒最重要的宿主。病毒可在鳥體內大量繁殖並形成高帶毒量的病毒血症，這一特徵是病毒傳播中的關鍵。值得注意的是，西尼羅病毒對鳥類的毒力僅見於最近在美國的流行。此現象又一次反映了西尼羅病毒近期的變異，其流行病學與生態學影響還有待長期觀察。人類與其他哺乳動物被認為是病毒傳播路徑中的“終端”。在人類，病毒血症僅存在於感染症狀出現前後很短(約一、兩天)的時期，且血中病毒含量很低，僅約 150pfu/ml，故此，在自然狀態下不太有機會將病毒播散出去。然而，特殊狀態下人羣間西尼羅病毒的傳播正在引起越來越廣泛的重視。2002年美國發現了23例輸血導致的西尼羅病毒感染（來源於16名帶毒獻血者）。從2003年六月起，美國開始以RT-PCR的方法對所有血製品進行檢查，到同年九月中旬，在檢查過的二百五十萬份血製品中有489份呈西尼羅病毒陽性。儘管如此，在2003年還是發生了兩例輸血導致的西尼羅病毒感染。器官移植是另一個潛在的西尼羅病毒傳播途徑。在2002年的一個案例報道中，一位西尼羅病毒帶毒者的器官被移植入4個病人的體內，其中的3個病人發生了西尼羅病毒腦炎。西尼羅病毒的母嬰傳播也是令人憂慮的問題之一，其首例感染亦發生於2002年。已知西尼羅病毒可穿過胎盤屏障導致子宮內胎兒的感染。西尼羅病毒是否可以通過母乳傳播尚無定論，是目前研究中的課題之一。

1999年西尼羅病毒腦炎在美國的流行是美洲大陸首次發生的西尼羅病毒自然感染。美國流行病學工作者能夠在疾病流行的初期，在僅有數名患者的時候即敏鋭地發現了一種未知傳染病的暴發，其高超的工作效率和職業技能實在令人讚歎。相形之下，由SARS暴發一案即可看出我國醫學、科技工作者在這方面的表現有所欠缺。有鑑於此，筆者願意在此簡要回顧一下1999年西尼羅病毒腦炎在美國的發現過程，希望各位同行從中能夠有所借鑑。

1999年8月23日，紐約市皇后區一位內科醫生報告了兩例疑似中樞神經系統感染病人，幾天後，又有兩位患者被這位醫生髮現。傳染病人的集中發現引起了公共衞生當局的重視。在同一周內，所有當地醫院的病歷被複查，共發現8位腦炎患者。這8位患者的共同特徵是1.都居住於一個約4英里×4英里的範圍內。2. 都為老年人，年齡58 – 87歲。3. 沒有發現共同的接觸史。4. 親屬中無人患病。5. 發病前都曾參加過夜間户外活動。6. 血清學檢查均呈聖路易腦炎病毒陽性。以上證據説明一場聖路易病毒導致的腦炎正在開始流行，已知聖路易腦炎病毒的傳播途徑為蚊蟲叮咬。9月2日，滅蚊行動開始在全城展開。

另一方面，從8月初開始，紐約市的野生鳥類，特別是烏鴉在大量死亡，但無人予以關注。最終，紐約市動物園珍稀鳥類的死亡引發了病原學調查，很快，從死鳥中分離得到了病毒：西尼羅病毒 – 一種從未在美洲自然感染中發現過的病毒。人們立即聯想到剛發現的病毒性腦炎病例，上述8位患者的血清立即用抗西尼羅病毒特異抗體再次檢測，結果陽性。至此，一場由西尼羅病毒導致的腦炎的暴發流行得以發現。接下來的問題是，西尼羅病毒腦炎是剛剛進入紐約，還是已經不為人知地流行已久？為回答這個問題，對紐約市過去三年中所有腦炎病人的血清標本進行了血清學檢查，皆為西尼羅病毒陰性。西尼羅病毒最近入侵美國得以證實。那麼，入侵美國的西尼羅病毒是從哪裏來的？Lanciotti 等人1999年12月在《Science》上發表的研究論文回答了這個問題。這篇文章中描述的工作質量上乘卻並不複雜晦澀。首先，由於西尼羅病毒與數種同屬病毒之間存在着抗原交叉性，Lanciotti 等人收集了多種針對黃病毒屬不同病毒的特異性單克隆抗體，與不同的黃病毒，包括多種不同來源的西尼羅病毒進行間接免疫熒光抗體交叉試驗，以證實流行於紐約的病毒確係西尼羅病毒。其次，Lanciotti 等人比對了多種來源西尼羅病毒的基因序列（一段長1278鹼基的prM和E基因）表明了紐約市人、鳥、蚊來源的西尼羅病毒之間的同源性顯著高於其他來源的西尼羅病毒，證實了西尼羅病毒在紐約市人、鳥、蚊之間的傳播關係。最後，通過對GenBank數據庫中40種不同來源西尼羅病毒的進化樹分析（比對一段255鹼基的E基因）表明了流行於紐約的西尼羅病毒與1998年從以色列分離的西尼羅病毒有着最高的同源性，進而説明流行於紐約的西尼羅病毒來源於以色列。至於病毒是如何從以色列來到美國的則可能成為一個永遠無法解開的謎。根據西尼羅病毒傳播的流行病學特徵，最大的可能性是在全球範圍內遷徙的鳥類或搭乘民航班機的蚊子。如前所述，病毒隨人類旅客傳播的可能性雖不能排除，但機會不大。

美國CDC在鑑定未知傳染病暴發流行方面一貫有出色表現，上世紀七十年代發現萊姆病，八十年代發現艾滋病都是很好的例子。儘管無法完全阻止疾病的流行，儘早地發現傳染性疾病的爆發、鑑定出病原體無疑對減少人民的生命財產損失有重大意義。

結語

我國目前尚未發現西尼羅病毒感染，是因為病毒尚未傳播至我國還是另有原因，其對我國有多大的潛在威脅是一個值得探究的問題。值得注意的是，西尼羅病毒感染不僅未發生於我國，在東亞地區都未見報道，而這一地區正是日本腦炎的流行區域。日本腦炎病毒與西尼羅病毒到底在人類中是否具有交叉保護性？是不是這種交叉保護性使得我國免受西尼羅病毒的侵染, 是一個很有意思的問題。