分辨率達到50納米！我國已具備高端超分辨光學顯微鏡研製能力
一聽到高端的光學顯微鏡，你是不是會立刻想到徠卡、蔡司、奧林巴斯這些國外品牌？現在，我國也具備了高端超分辨光學顯微鏡的研製能力。
據“科學大院”公眾號（kexuedayuan）12月29日消息，中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所（簡稱“蘇州醫工所”）已經研製出了激光掃描共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡、受激發射損耗(STED)超分辨顯微鏡、雙光子-STED顯微鏡等高端光學顯微鏡。
12月26日，由蘇州醫工所承擔的國家重大科研裝備研製項目“超分辨顯微光學核心部件及系統研製”通過驗收，標誌着我國具備了高端超分辨光學顯微鏡的研製能力。
科研人員正在用自主研製的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞結構（圖片來源：中科院攝影聯盟、蘇州醫工所）
探索微觀世界 離不開高端顯微鏡
高端顯微系統廣泛應用於生物學和基礎醫學等相關前沿領域的創新研究，尤其是10-100nm尺度的超分辨顯微光學成像技術，在當今生物學和基礎醫學研究中，發揮着不可替代的作用。
作為生物醫學實驗研究的必備工具，激光掃描共聚焦顯微鏡比傳統的熒光顯微鏡分辨率更高，而且可以進行層析掃描3D成像。但是共聚焦顯微鏡能夠觀察的樣品厚度一般小於100um，要觀察更深的樣品時需要藉助雙光子顯微鏡。雙光子顯微鏡最大的優勢是觀察的深度。
但是無論是激光掃描共聚焦顯微鏡還是雙光子顯微鏡，都無法擺脱衍射極限的限制，為了進一步探索微觀世界，需要分辨率更高的顯微鏡。STED顯微鏡應運而生，它在共聚焦顯微鏡的基礎上引入損耗光束將熒光光斑進一步壓縮，從而實現超分辨成像。
數值孔徑為1.45的平場復消色差顯微物鏡（圖片來源：中科院攝影聯盟、蘇州醫工所）
我們都知道，美國和日本都是諾貝爾獎大國，日本從2000年開始基本每年一個諾貝爾獎，其中的原因之一就是離不開顯微鏡等高端儀器的使用。我國雖然是顯微鏡消費大國，但自己只能生產中低端產品，高端儀器基本依賴於進口，這已經嚴重製約了我國生物學和基礎醫學等相關前沿領域的創新研究。
四台高端顯微鏡 Made in China！
歷時五年攻關，蘇州醫工所科研人員全面突破大數值孔徑物鏡、特種光源、新型納米熒光增強試劑、系統集成與檢測等關鍵技術，研製出四台高端顯微鏡，為我國高端光學顯微鏡的發展提供了系統解決方案。
高端平場復消色差生物顯微物鏡（圖片來源：中科院攝影聯盟、蘇州醫工所）
下面我們就來看看這四大國貨神器吧！
1. 激光掃描共聚焦顯微鏡
傳統熒光顯微鏡是用光源照射整個樣品平面，再獲得圖像。由於聚焦平面上下的平面也會受到激發產生熒光，圖像會被幹擾；同時，同一平面上特徵點周圍激發的熒光也會干擾特徵點的觀察。
**激光掃描共聚焦顯微鏡採用聚焦後的激光光斑作為照明光源，同時在探測器前引入針孔將聚焦光斑外的干擾信號進行過濾，因此提高了圖像信噪比，橫向分辨率可達200nm左右。**此外，激光共聚焦顯微鏡還可以對樣品逐層掃描實現三維成像，以及利用多通道採集圖像的功能同時獲取不同光譜段的熒光掃描圖像。
激光掃描共聚焦顯微鏡與普通熒光顯微鏡成像對比（圖片來源：網絡）
蘇州醫工所研製的激光掃描共聚焦顯微鏡樣機（圖片來源：蘇州醫工所）
激光共聚焦顯微鏡可以觀察細胞或亞細胞形態結構、鑑定細胞或組織內生物大分子，如：檢測蛋白質抗體及其他分子，檢測細胞凋亡，觀察細胞骨架結構等；還能進行活體細胞或組織功能的實時檢測。
目前，利用蘇州醫工所研製的高端光學顯微鏡，中科院動物所觀察發育生物學中的基本現象，研究潛在調控機制；中科院藥物所觀察藥物胞內靶向定位和輸送，加速創新性新藥研發。
納米藥物在Caco-2細胞亞細胞器分佈共聚焦成像（圖片來源：中科院上海藥物所）
小鼠卵母細胞紡錘體共聚焦成像（圖片來源：中科院動物所）
2.雙光子顯微鏡
雙光子顯微鏡結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發技術的特點。
雙光子激發技術的基本原理就是用兩個波長較長的光子去激發一個熒光分子。由於光波波長較長，可實現成像深度超過600微米。那麼問題來了，什麼情況下可以用兩個光子激發一個光子，實現能量疊加呢？答案是：提高光子密度。
在進行雙光子成像時，物鏡焦點處的光子密度是最高的，雙光子激發只發生在物鏡的焦點附近很小的區域內，鄰近區域不產生熒光，因此不需要針孔過濾信號，提高了信號收集效率。
單光子（共聚焦）激發與雙光子激發（圖片來源：網絡）
蘇州醫工所研製的雙光子樣機圖（圖片來源：蘇州醫工所）
目前雙光子成像在生物醫學領域廣泛應用於深層組織成像以及活體成像等。美國斯坦福大學、日本東京大學、陸軍軍醫大學腦科學研究中心等專業實驗室利用雙光子顯微成像技術進行了信息識別、行為控制等腦科學核心問題的研究以及動物在體成像實驗，獲得了高分辨實時神經元活動成像數據。
CLARITY處理的Thy1-YFP（H Line）小鼠大腦的熒光觀察（圖片來源：網絡）
（A）從大腦皮質到海馬的3-D觀察圖像（B）大腦皮層Ⅴ層的錐體細胞的樹突圖像
3.受激發射損耗（STED）顯微鏡
傳統光學成像由於受到光學衍射極限的限制，分辨率很難突破200nm。這時就需要超分辨顯微鏡出手了。
光學衍射極限降低分辨能力（圖片來源：網絡）
STED顯微鏡是一種超分辨顯微鏡，它的原理可以簡單理解為在共聚焦顯微鏡的基礎上加入一束麪包圈狀的光斑（我們稱之為損耗光），通過受激輻射效應減小有效熒光發光面積，將被激發的熒光物質限制在衍射極限內，從而突破光學衍射極限實現超分辨成像，目前能夠實現50nm分辨率。
STED原理（圖片來源：網絡）
細胞骨架共聚焦與STED對比圖（圖片來源：蘇州醫工所）
蘇州醫工所研製的STED樣機圖（圖片來源：蘇州醫工所）
STED顯微鏡的應用領域與共聚焦顯微鏡相似，主要用於觀察亞細胞形態結構，活細胞內生物分子的實時成像和動態跟蹤等。目前，蘇州醫工所正與中科院上海藥物所以及中科院北京動物所開展相關合作。
4.雙光子STED顯微鏡
雙光子STED顯微鏡將雙光子顯微鏡與STED顯微鏡合二為一，結合雙光子顯微鏡成像深度深以及STED顯微鏡分辨率高的優點，根據不同的成像需求選擇合適的成像方式。
蘇州醫工所研製的雙光子-STED顯微鏡（圖片來源：蘇州醫工所）
目前，蘇州醫工所已聯合吉林大學第一醫院、復旦大學附屬華山醫院以及蘇州大學附屬第一醫院針對難治性癲癇、帕金森病及缺血性腦卒中疾病等進行研究。
科研人員正在用自主研製的雙光子-STED顯微鏡觀察亞細胞結構（圖片來源：中科院攝影聯盟、蘇州醫工所）
小鼠腦切片雙光子成像（圖片來源：蘇州醫工所）
導師，咱們實驗室也買一台？
在高端顯微鏡的研製過程中，設計、加工、裝配、檢測等等，並無現成標準、經驗可循；關鍵光學器件的加工難度超乎想象。
這次通過項目驗收的四套超分辨率顯微鏡，最高分辨率達到了50納米，而且各有特色。“在它們的背後，是已經發展起來的顯微光學設計、加工、製造、裝配的完整技術和工程體系。”例如大數值孔徑顯微物鏡，不過兩個膠囊咖啡大小的物鏡，卻由十幾片直徑為1-30毫米的特種玻璃鏡片裝配而成，做出這樣一個鏡頭，需要解決一系列難題，更需要精密的檢測設備和嚴格的檢測標準。
高精度顯微物鏡光學元件加工（圖片來源：中科院攝影聯盟、蘇州醫工所）
目前，蘇州醫工所研製的顯微鏡和關鍵部件已有部分成果實現銷售，例如：雙光子顯微鏡已銷往德國、以色列、美國等多家國外研究機構。北京大學、中科院神經科學研究所等國內科研機構也使用了該設備。具有自主知識產權的特種LED光源體系具備了國際競爭力，支撐了包括新一代投影、光醫療儀器以及遠程照明等新興產業的快速發展。共聚焦顯微鏡也已完成工程化，擬進行產業化生產和銷售。
該項目的成功實施，極大改善了我國高端光學顯微鏡基本依賴進口的狀況，對滿足我國生物醫學等前沿基礎研究的定製化需求、提升創新能力，以及推動我國光學顯微鏡行業轉型升級具有重要的戰略意義。
（作者單位：中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所）