新晉生理醫學諾獎得主凱林“十誡”：做實驗的時間和論文數量線性相關_風聞

編譯 | 鹹姐、曉雨

撰文 | 韓若冰、繼省

昨日，2019年諾貝爾生理學或醫學獎頒發給了哈佛醫學院的小威廉·凱林（William Kaelin. Jr）、牛津大學的彼得·拉特克利夫爵士（Peter J. Ratcliffe）和約翰霍普金斯大學的格雷格·塞門扎（Gregg L. Semenza）（圖1） 。三位科學家因發現動物細胞如何適應氧氣張力的變化（“for their discoverys of how cells sense and adapt to oxygen availability”）而受到表彰。

曾經與諾獎得主小威廉·凱林在Dana-Farber癌症研究所共事的Wenhua Gao為我們分享了凱林實驗室的獨門“十誡”。

這份“十誡”有兩個版本。2005年的第一版中，一些條目出自凱林當年做博士後時的導師大衞·利文斯頓（David Livingston），科學家們優秀的治學作風一脈相承。“十誡”的頭一條這樣寫道：”When I was a post-doc in David’s lab…（當我還是大衞實驗室的一名博士後時……）”，傳遞出凱林與導師的深切感情和他對漫漫科研長路的回味。

新版“十誡”自2017年推出，字裏行間不乏“老學究”的小調皮，比如下面這條：

”Trust me on this, I have been doing this for __ years!” *Fill in blank by taking current years and subtracting from 1992.

“這事你信我就對了，我已經在這方面做了__年了！” *空白處填上當前年份減去1992年。（意思是凱林從1992年起就開始從事該領域研究。）

10. “There are two types of scientists. One whose worst nightmare is to be second, the other whose worst nightmare is being wrong. You have to decide which kind you want to be.”

9. “There is an almost linear correlation between hours at the bench and number of papers.”

8.“Unless proven otherwise, all loss of fitness phenotypes are off-target”

7. “What you have here is an analog result, but what you want is a digital result”

6.“Where is the rescue?”

5. “Robustness and reproducibility are NOT the same thing”

4.“What is the most trivial explanation for these data?”

3.“The experiment is only as strong as your controls”, sometimes phrased as “Nothing is sadder than a blank blot”

2.“Trust me on this, I have been doing this for__years!”

· Fill in a blank by taking current year and subtracting from 1992.

1.“The honeymoon is over”

·· Hint: the honeymoon lasts a year

凱林在學術之餘對體育也充滿熱情。他是一位鐵桿籃球迷，在新舊兩版“十誡”上都不吝表達自己對北卡羅萊納大學(UNC)籃球隊的喜愛，甚至用大字體印上”Go HEELS!!!（北卡衝啊！！！）”

凱林通過這樣的形式傳達對博士後團隊的諄諄教誨。“Where is your rescue?”凱林問道。Wenhua介紹説，做RNA干擾(RNAi)或者是CRISPR 敲除實驗時，出現表型(phenotype)後應該把原基因再表達回去，看看該表型是否可以逆轉，這叫作“挽救實驗（rescue experiment）”，其目的是為了去掉脱靶的可能性。尤其是在RNAi後，如果看到對細胞生存的負面效應，必須做挽救實驗，以確保該現象不是脱靶效應導致的。

其他的條目也很有意思，歡迎大家討論討論每一條的含義~

低氧研究正當時

諾貝爾生理學或醫學獎授予的是能帶來“人類最大福祉”的科學發現，那麼今年獲獎的這一發現對人類健康的直觀意義何在？未來發展前景又如何？

帶着這些疑問，我們和美國德克薩斯大學西南醫學研究中心（UT Southwestern Medical Center）的張青教授進行了對話。張教授長期從事細胞低氧反應研究，在2006至2011年間，曾在今年諾獎得主之一凱林的實驗室工作。

張教授介紹，氧感知是一個普遍存在的現象，在癌症中亦是如此。HIF抑制劑對於癌症治療意義重大，目前正有HIF-2α抑制劑治療腎癌的臨牀試驗，而HIF-1α抑制劑的開發仍很有挑戰性。同時，氧感知通路的研究既包括依賴HIF的信號通路，也包括與HIF無關的信號通路。例如，HIF-2α抑制劑僅對50%的腎癌患者有效。因此，研究多種信號通路對於開發新的單獨或聯合使用的治療方法都具有重要意義。

儘管至今仍然沒有直接抑制HIF的藥物被批准用於癌症治療，不過，去年一種HIF-PH（脯氨酸羥化酶）抑制劑新藥羅沙司他(Roxadustat)在中國率先獲批上市，用於治療因慢性腎臟病 (CKD) 引起的貧血。據估計，中國的CKD患者已過億，2017年血液透析患者保守估計在50萬人以上，且呈快速增長趨勢。羅沙司他膠囊的上市為因CKD引起貧血的國內患者帶來了新的治療希望。張教授説道，這一藥物的研發可以説是諾獎研究成果帶來的一項直接結果。

除了在治療貧血方面的成效，脯氨酸羥化酶抑制劑未來可能會在炎症性腸病等方面產生更廣闊的臨牀應用，許多相關臨牀試驗也正在進行中。

從與張教授的對話中我們瞭解到，以HIF為核心的細胞低氧適應研究在貧血方面的應用價值苗頭初顯，而在癌症等臨牀領域內的研究更是方興未艾。經諾獎進一步加持，可以預見HIF相關的研究會進一步吸引研究者的目光。

詳解氧感知通路

01 氧，生命的燃料

18世紀末，瑞典藥劑師卡爾·舍勒（Carl Scheele）認定，大約四分之一的空氣是“火氣”，即大氣中可以讓物質燃燒的成分。與此同時，英國的神學家和哲學家約瑟夫·普利斯特里（Joseph Priestley）發現了一個提純這種氣體的方法。在一次與普利斯特里的偶遇後，法國貴族、政治家、科學家安託萬·拉瓦錫（Antoine Lavoisier）成功地複製了普利斯特的提純方法，並將提純到的物質命名為“氧”。後來，普利斯特里和拉瓦錫親眼目睹他們的實驗室被暴徒摧毀；拉瓦錫不久就被處死了，而普利斯特里逃到了美國。儘管他們的實驗室被燒燬，但 “氧”這種其氣體作為生命的燃料依舊立於生命研究的中心地帶。

雖然氧氣是細胞呼吸的必要因素，但從貝尚（Bechamp）和巴斯德（Pasteur）開始，人們就知道細胞呼吸過程其實是更復雜的氧平衡的一部分：動物可以利用多種途徑來完成能量生產，包括在必要時轉換到厭氧發酵。到上個世紀中葉，這種多方位的適應能力已經成為生化知識領域中的一條常識。但是，在三位科學家做出他們的貢獻之前，這種適應性在基因表達水平上如何被調控，人們還完全不清楚。

02 低氧誘導因子（HIF）

眾所周知，許多對氧氣水平的生理和代謝反應都是轉錄層面的。信使RNA（mRNA）編碼了許多糖酵解酶**[1，2****]、血管生成因子（VEGF）[3****]和促紅細胞生成素[4****]**等一系列蛋白；當細胞中的氧氣水平下降時，受低氧條件刺激，編碼上述這些蛋白的mRNA含量就會升高，讓機體適應低氧環境。例如，促紅細胞生成素升高，機體生成更多的紅細胞，攜帶更多的氧，以滿足機體的需要。

人們在基因中分離出一些專門響應氧氣水平的序列，稱為HRE（hypoxia-responsive element），或低氧反應元件**[5****]。賽門扎和拉特克利夫的團隊都積極地參與這些調控序列的鑑定，尋找結合低氧反應元件的因子。在這場競賽中，塞門扎的研究小組率先克隆了一個轉錄因子，稱之為HIF（hypoxia-inducible factor），意為低氧誘導因子[6****]**。

後續的研究逐步發現，在很多氧氣調節的基因中都存在低氧反應元件，而低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）可以直接調控數百種mRNA的表達。通過HIF作用改變基因表達，幾乎影響了細胞生理和代謝的方方面面，這對動物細胞適應體內和環境中不斷變化的氧氣水平至關重要。

早期的研究表明，有機體的發育和體內穩態維持在許多方面都依賴於HIF的作用；同時，癌症、炎症、組織損傷和癒合等機體面臨的諸多挑戰也都與HIF的應答有關。這方面的工作進展迅速，實驗反覆表明，從免疫反應、心血管功能一直到神經控制，HIF介導的氧化反應在整個生物學領域中都很重要。也正因如此，當人們後來又發現HIF參與大量疾病發生髮展過程時，沒人覺得驚訝了。

03 對氧氣敏感

賽門扎發現，HIF是一個由兩個鹼性螺旋-環-螺旋家族因子組成的DNA結合二聚體。這個二聚體的一部分是HIF-1α；另一部分最先被稱為HIF-1β，後來才發現它正是之前就被克隆出來的芳烴受體核轉運蛋白。由於HIF-1β對氧氣水平並不敏感，人們認識到一個重要事實——對氧氣敏感的HIF-1α才是細胞響應低氧條件的關鍵。

那麼，問題來了，HIF-1α又受誰的調控呢？不同於往常研究的是信號轉導之類的事件，這個問題的答案必須落實到對氧氣水平的直接反應——即氧氣本身的水平。凱林和他的合作者發現，腫瘤抑制因子VHL（與von Hippel-Lindau家族性癌症相關）的突變會導致HIF調節基因的表達增加**[7****]。隨後，拉特克利夫團隊又發現，在缺乏VHL的細胞中，HIF-1α對氧氣改變所產生的變化消失了[8****]**。考慮到VHL參與泛素化和蛋白質更替，這個發現為HIF-1α的調控提供了一個潛在的機制。

04 調控機制：氧水平究竟怎樣調節細胞

這之後最關鍵的研究，就是拉特克利夫和凱林團隊發現HIF-1α蛋白中的脯氨酸殘基被羥基化——這個羥基化修飾對於VHL複合物的結合至關重要**[9，10****]。隨後，拉特克利夫團隊，以及Bruick和McKnight分別發現了催化這種修飾的候選脯氨酰羥化酶（PHD）[11，12****]**。鑑於脯氨酸羥化作用需要分子氧的參與，這就在理論上建立了一個細胞在翻譯後水平調節HIF的模型（圖2）：

圖2 氧氣敏感性轉錄調控機制。HIF-1α轉錄因子的調控通過特定脯氨酸殘基的標記進行，這個過程需要脯氨酰羥化酶（PHD）在細胞內氧氣的影響下催化產生。一旦被修飾，HIF-1α轉錄因子即被VHL複合體識別，進而催化其泛素化和經由蛋白酶體的降解過程（左）。缺氧時，HIF-α轉錄因子不能被PHD催化修飾，最終在細胞核內積累，從而誘導HIF靶基因轉錄，以使細胞適應低氧環境（右）。

隨着氧氣水平的降低，HIF的羥化作用減少，從而導致VHL複合物的結合減弱，泛素化程度降低，HIF-1α的蛋白酶體降解作用減弱，最終，HIF-1α（及其異構體HIF-2α[13-15****]）在缺氧狀態下積累，從而誘導基因表達，幫助細胞調整在低氧水平下的生存方式。賽門扎之後發現了一種HIF抑制劑——FIH[16****]，為這個模型又增加了一個微妙之處。FIH也是一個羥化酶，雖然它在HIF-1α蛋白的不同區域通過改變通路的轉錄激活而不是調節HIF蛋白質轉換起作用，但是其活性改變也是受氧氣介導的**[17****]**。

許多研究團隊的工作已經證明，HIF的氧感知通路堅實可靠，在調節氧氣影響的基因表達中起關鍵作用。在HIF的發現過程中，這三位研究人員憑其發現是當之無愧的核心人物，引領着這項工作的進程。他們不僅積極參與對HIF調節的分子生物學過程的逐步闡釋，而且幫助我們更深地理解了低氧反應在健康和疾病中所起的生理作用。

調節HIF- 1α穩定性的脯氨酸羥化酶的發現，使人們能夠尋找抑制劑，這為藥理學研究開闢了新的途徑。事實上，多個影響HIF功能的潛在藥物已經在臨牀試驗中取得了很大進展。目前的臨牀研究主要集中在對於貧血的治療上，這使工作回到其最初的目標之一，即操縱促紅細胞生成素的表達。但考慮到HIF影響的疾病範圍，今後肯定會有更多的臨牀應用出現。

參考文獻

[1] Firth JD, Ebert BL, Pugh CW, Ratcliffe PJ (1994) Oxygen-regulated control elements in the phosphoglycerate kinase 1 and lactate dehydrogenase A genes: Similarities with the erythropoietin 3′ enhancer. Proc Natl Acad Sci USA 91(14):6496–6500.

[2] Semenza GL, Roth PH, Fang HM, Wang GL (1994) Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia- inducible factor 1. J Biol Chem 269(38):23757–23763.

[3] Shweiki D, Itin A, Soffer D, Keshet E (1992) Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. Nature 359(6398):843–845.

[4] Schuster SJ, Wilson JH, Erslev AJ, Caro J (1987) Physiologic regulation and tissue localization of renal erythropoietin messenger RNA.Blood 70(1):316–318.[5] Semenza GL (1994) Regulation of erythropoietin production. New insights into molecular mechanisms of oxygen homeostasis.Hematol Oncol Clin North Am 8(5):863–884.

[6] Wang GL, Semenza GL (1995) Purification and characterization of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem 270(3):1230–1237.

[7] Iliopoulos O, Levy AP, Jiang C, Kaelin WG, Jr, Goldberg MA (1996) Negative regulation of hypoxia-inducible genes by the von Hippel-Lindau protein. Proc Natl Acad Sci USA 93(20):10595–10599.

[8] Maxwell PH, et al. (1999) The tumour suppressor protein VHL targets hypoxia-inducible factors for oxygen-dependent proteolysis. Nature 399(6733):271–275.

[9] Ivan M, et al. (2001) HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: Implications for O2 sensing. Science 292(5516):464–468.

[10] Jaakkola P, et al. (2001) Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation. Science 292(5516):468–472.

[11] Epstein AC, et al. (2001) C. elegans EGL-9 and mammalian homologs define a family of dioxygenases that regulate HIF by prolyl hydroxylation. Cell 107(1):43–54.

[12] Bruick RK, McKnight SL (2001) A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that modify HIF. Science 294(5545):1337–1340.

[13] Tian H, McKnight SL, Russell DW (1997) Endothelial PAS domain protein 1 (EPAS1), a transcription factor selectively expressed in endothelial cells. Genes Dev 11(1):72–82.

[14] Hogenesch JB, et al. (1997) Characterization of a subset of the basic-helix-loop-helix-PAS superfamily that interacts with components of the dioxin signaling pathway. J Biol Chem 272(13):8581–8593.

[15] Ema M, et al. (1997) A novel bHLH-PAS factor with close sequence similarity to hypoxia-inducible factor 1alpha regulates the VEGF expression and is potentially involved in lung and vascular development. Proc Natl Acad Sci USA 94(9):4273–4278.[16] Mahon PC, Hirota K, Semenza GL (2001) FIH-1: A novel protein that interacts with HIF-1alpha and VHL to mediate repression of HIF-1 transcriptional activity. Genes Dev 15(20):2675–2686.

[17] Lando D, et al. (2002) FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the transcriptional activity of hypoxia-inducible factor. Genes Dev 16(12):1466–1471.

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