解密1918流感：人類的生存保衞戰，百年也不會結束 | 展卷_風聞

撰文 | 丁強（清華大學醫學院）

病毒性疾病的傳播不需要“簽證”，並沒有國界和地域的限制，傳染性疾病的控制不僅僅是政府的事情，也需要普通民眾、學術界、工業界和政府的廣泛參與，精誠合作。在傳染性疾病面前，所有的人類都是命運共同體。

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1918年是人類歷史上的至暗時刻。此時的中國陷入南北分裂、軍閥割據、相互混戰的年代；大洋彼岸，第一次世界大戰爆發，歐洲四分五裂，屍橫遍野，無數年輕人在泥濘的戰壕中不知為何而戰鬥。更為可怕的是，一種看不見的病毒正逐漸在世界範圍內擴散，這是人類歷史上最致命的流感病毒，於1918年席捲全球，共造成約5000萬人死亡，僅一年的死亡人數就超過了1347-1353年黑死病（歐洲鼠疫）肆虐六年的戰績（2500萬人死亡）。除了極高的致死率，本次流感的另一特點是：年輕人，特別是20-40歲的人，死亡率最高。

1918年，美國堪薩斯州賴利堡（Fort Riley）的軍營醫院，病房被患西班牙流行性感冒的軍人塞滿。 | 來源：https://en.wikipedia.org/wiki/Spanish_flu

這一病毒最先在西班牙公佈，因此這次疫情也稱為“西班牙流感”。“西班牙流感”病毒輕輕地來，悄悄地走，沒有帶走一片雲彩，18個月後便完全神秘地消失。但是，造成這次大流感的病毒是什麼樣子？從哪裏來？為什麼致死率如此之高……這些都成了當時的“懸案”。

想要破解這些“懸案”，首先得找到“犯罪分子”。然而，已經銷聲匿跡的病毒，怎能夠起死回生呢？

在電影《侏羅紀公園》中，從一隻吸了恐龍血後嵌在琥珀中的蚊子身上，一位科學家提取了恐龍的DNA，成功複製（克隆）出了恐龍，建成“侏羅紀公園”供遊人參觀。電影導演的想象力十分豐富，但是具有一定的科學道理。1918年流感病毒的“復活”和電影的橋段如出一轍，只要拿到該病毒的基因組信息（流感病毒基因組是由8股單鏈RNA片段組成，分別是HA、NA、M、PA、PB1、PB2、NP和NS，共編碼11個病毒蛋白質），科學家就可以利用分子病毒學技術，克隆出將病毒的基因，生產出病毒（反向遺傳學系統），並且可以任意修改病毒的基因組。

獲取病毒樣本

《侏羅紀公園》裏，科學家是通過提取吸了恐龍血的蚊子DNA來找到恐龍DNA的。1918年流感病毒已經隨着病人的死去也跟着消失，科學家們是如何尋找它的蹤跡的呢？這裏必須提到兩位科學家，分別是Johan Hultin和Jeffery Taubenberger。

Johan Hultin是瑞典人，1924年出生，後來移民美國，在愛荷華大學（University of Iowa）讀醫學博士。Johan是一個多才多藝，喜歡到處闖蕩的人，他設計了提高汽車安全系統的方案，被美國交通部採用；他也是年紀最大的、在我國慕士塔格峯（海拔7500米）滑雪的人。可能是瑞典人骨子裏有滑雪的傳統，已故著名分子免疫學家Jürg Tschopp教授也是科學界的滑雪高手。

1950年，布魯克黑文國家實驗室 (Brookhaven National Laboratory) 的William Hale博士訪問愛荷華大學，在報告中談及1918年大流感，提到“或許應該去北極地區尋找永久凍土層下面的1918年流感罹難者來尋找病毒的蹤跡”。言者無心，聽者有意，Johan立刻和導師Albert McKee博士提出自己想去阿拉斯加尋找1918年流感病毒，以此作為自己的博士論文。26歲的Johan意氣風發，呼朋喚友，立刻出發前往阿拉斯加，開始了他的病毒偵探之旅。

他來到阿拉斯加一個叫做Brevig Mission的村子。這個村子在1918年約有80人，但是據記載，在當年11月15日至20日期間，流感病毒在短短五天內奪去了72人的生命。Johan堅信，他能在這裏找到1918年流感病毒的蹤跡。1951年夏天，經過村落中長者的同意，他開始挖掘流感病死者的墓地。挖掘凍土層非常困難，Johan和同事生起火，將地面烤暖進行挖掘。挖掘工作持續了數天，Johan找到了多具流感患者屍體，並取得了死者肺部組織樣品。然而，當他回到愛荷華大學實驗室，將肺部組織樣品去感染雞胚，卻並沒有使病毒復活。Johan的偵探之旅就這樣以失敗告終**[1-2****]**。

多年之後，又有一位科學家Jeffery Taubenberger博士想尋找1918年流感病毒。Jeff 1961年出生於德國，9歲時跟隨在五角大樓工作的父母來到美國，後分別在1986年和1987年獲得醫學博士 (MD) 和哲學博士 (PhD) 學位，1988年進入美國國立健康研究院（NIH）的國家癌症研究中心（NCI）進行病理學研究。1993年，Jeff進入美國武裝部隊病理學研究所（Armed Forces Institute of Pathology，AFIP）參與組建一個新的實驗室，旨在將當時新的分子生物學技術引入到研究所的病理學研究中。1994年，他被提升為分子病理學部的主任（Chief of the Division of Molecular Pathology），擁有了自己的實驗室，可以自由研究一些基礎科學問題。

病理學研究所收集有1918年流感盛行期間死亡的戰士的病理標本，Jeff在其中一名死者——美國南卡羅萊納州的21歲士兵（死於當年9月）——的肺部發現了1918流感病毒RNA**[2-3****]。比Johan更為幸運的是，此時，聚合酶鏈式反應(PCR）技術已經比較成熟。這一技術發明於80年代，是一種體外核酸擴增技術，能在試管內將微量的DNA或者RNA片段於數小時內以指數增長的方式擴增至十萬乃至百萬倍，無愧是生物醫學領域中的一項革命性創舉。1997年，Jeff和同事Ann Reid等利用PCR技術，分別克隆了1918流感病毒的四條基因（HA, NA, NP和Matrix基因）的部分序列，並進行測序。通過有限的部分序列信息，Jeff基本確定了1918年流感病毒為H1N1型流感病毒[4****]**。

但是，經過近80年福爾馬林和石蠟的保存，病理樣品的病毒核酸破壞嚴重，PCR效率不高，從屍檢獲得的微量組織不足以支持後續研究，難以得到完整的病毒基因組序列。不過，這個問題馬上得到了解決：73歲退休在家的Johan居然還讀論文——他在《科學》（Science）雜誌上看到Jeff發表的文章，心中重燃追尋1918流感的熱情，決定繼續遠征！Johan聯繫了Jeff，表示可以重回Brevig Mission，獲取埋在永久凍土層的病死者肺部組織。Johan重獲當地的許可，於46年之後，再一次嘗試挖掘1918年流感罹難者屍體。

此次挖掘獲得了4名流感罹難者的冰凍肺部檢體，其中一位大約30歲的肥胖女性（取名為Lucy）身上取出的肺部組織含有大量高質量的流感RNA。這名女性的脂肪保護了肺部組織免於腐爛，因此也保留了病毒的RNA。利用這份珍貴的樣品，Jeff團隊分別在1999年測定了HA的完整序列**[5****]，2000年測定了NA的完整序列[6****]，2001年測定了NS1的完整序列[7****]，2002年測定了Matrix的完整序列[8****]，2004年測定了NP的完整序列[9****]，最終在2005年測定了病毒聚合酶基因（PA, PB1, PB2）的完整序列[10****]**，至此，從1997到2005年，9年時間，1918年流感病毒的8條全基因組序列測定完畢。筆者感慨，Johan生不逢時，如果在1951年就有PCR技術，或許Johan的博士論文就順利多了，1918年流感病毒的真面目也會早早揭開；另外，在二代測序技術發達的今天，可能Jeff團隊9年的工作在幾個小時之內就能完成…… 想起牛頓的一句話“我之所以看得更遠，是因為我站在巨人的肩膀上”。

If I have seen further, it is by standing on the shoulders of giants.   by Isaac Newton

復活1918年流感病毒

70年代興起的DNA重組技術，是生物醫學領域具有里程碑意義的事件。人類可以像做工程一樣，對DNA進行克隆和改造。2005年，科學家們已經獲得1918年流感病毒的全基因組序列，對它的來源有了一定的認識。美國亞利桑那大學的Michael Worobey及其同事利用分子時鐘的研究方法，指出1918年H1N1流感病毒是人的H1病毒和禽類的N1病毒重組的結果**[11****]**，但是由於缺乏這之前的流感病毒的基因序列信息，不能進行充分的遺傳分析，所以他的“重組來源説”仍存在一定的爭議。

我們知道，基因序列固然重要，但是基因序列不能回答1918流感病毒為何有如此高的致病性。為了進一步研究這個問題，科學家們便開始利用DNA重組技術，參照病毒基因組序列“復活”1918年流感病毒，這和《侏羅紀公園》打算復活恐龍的想法大同小異。

美國紐約市中央公園旁西奈山醫學院的Peter Palese博士和Adolfo Garcia-Sastre博士在1999年就開發了將流感病毒基因組克隆到特殊的DNA載體，產生重組活流感病毒的技術（反向遺傳學技術），這項技術是研究流感病毒基因功能有效的遺傳學工具（威斯康辛大學麥迪遜分校的Yoshihiro Kawaoka博士也獨立開發了該技術）[12-14****]。所以，Peter和Adolfo打算利用這一技術“復活”1918年流感病毒——這立刻引起社會輿論的軒然大波。美國疾病預防與控制中心（CDC）經過慎重考慮和多重評估，認為該項研究可以為保護公共安全提供重要信息和為應對將來流感大爆發提供對策（“The fundamental purpose of this work was to provide information critical to protect public health and to develop measures effective against future influenza pandemics.”），最終決定實施病毒的“復活”計劃，但是必須在嚴格的生物安全保障下進行。在CDC諸多的嚴格規定中，有一條是：只允許受過嚴格訓練的流感專家Terrence Tumpey博士開展復活實驗。

Terrence在2005年夏天開始“復活”工作。為了減少風險，他只能承擔此一項課題，且只能在同事不在實驗室的下班時間開展實驗。也只有他的指紋可以進入復活流感病毒所使用的“升級版生物安全3級（BSL-3E）實驗室”，並且存放病毒樣品的冰箱也僅僅可以通過他的虹膜識別系統才能打開。同時，他每天需要服用抗流感病毒藥物奧司他韋（Oseltamivir），以防止感染。Terrence也簽署了知情同意書，如果他不幸被感染，將會被隔離，不能與外界接觸。

2005年7月，利用反向遺傳學系統，Terrence使用Peter Palese博士提供的載體，將病毒基因分別克隆到載體中，然後將載體一同導入體外培養的人腎上皮細胞系（293T）中，等待病毒的復活。當看到1918年流感病毒復活時候，Terrence意識到，他們創造了歷史——一個已經絕跡的病毒通過科學家的努力和智慧被賦予了新的生命。他在高度防護的實驗室裏（BSL-3E），打開了“潘多拉”的盒子。

科學家們隨即展開了對1918年流感病毒致病機制的研究。研究表明，這種病毒在小鼠體內肺部組織的複製能力以及致病能力比其他流感病毒顯著增強。用1918年流感病毒與Tx/91 (1991年在美國德克薩斯州分離得到的H1N1病毒株) 分別以106病毒劑量感染小鼠（每組感染13只小鼠），在感染2天后，前者即可導致小鼠體重下降13%，而Tx/91病毒感染的小鼠體重基本沒有變化；前者感染的小鼠在感染3天后開始出現死亡，5天后全部死亡，而Tx/91病毒感染的小鼠直到實驗結束也沒有死亡現象。在感染第四天後，小鼠的肺部組織中，1918年流感病毒的病毒載量是Tx/91病毒的39000倍，並且引起嚴重的肺部損失，並伴隨嚴重的肺部炎症，引起肺功能衰竭**[15****]**。

後續進一步研究發現，1918年流感病毒會引發強烈的免疫系統應答，產生“細胞因子風暴”——免疫細胞大量活化，引發細胞因子和炎症分子大量、快速釋放，這種過度反應會使機體出現超負荷狀態，出現嚴重炎症和肺部積液，增加繼發感染幾率**[16****]**。年輕、健康的成年人免疫系統較強，通常更容易產生“細胞因子風暴”，這也解釋了在1918年流感中為什麼年輕、健康的成年人反而死亡率更高。

至此，科學家們經過多年的努力（1951-2006年），藉助於分子生物學技術，終於揭開了1918年流感病毒的神秘面紗。我們對病毒從何而來，病毒的遺傳信息是什麼，以及為什麼會在青年人中引起如此高的死亡率有了清晰的認識。

遠未結束的戰爭

人人聞之色變的“西班牙流感”已是一個世紀前的陰影了。曾經，人類面對病毒性疾病束手無策，只能被動接受死神的宣判。然而，在過去的一百年裏，人類從未停止過對大自然的探索，在科學和醫學上取得了巨大的進步，現在應對新發和再發傳染性疾病的能力已大大加強。逐漸從被動挨打，到主動出擊，我們現在掌握的分子病毒學技術可以對病毒進行工程化改造和設計，按照我們的意願生產病毒——這便是疫苗的來源。但是，分子病毒學技術是一把雙刃劍，如何安全地運用這項技術，以及在何種情況下運用這項技術，需要經過嚴格考量。我們不希望“基因編輯嬰兒”類似事件的發生，我們希望我們可以正確地利用分子病毒學技術探索大自然，認知病毒，造福人類。

隨着全球化進程的快速發展，以及人和自然交互變得逐漸頻繁，我們面臨新發和再發傳染性疾病的威脅也日益加劇，病毒的傳播速度也大大加快。我們可以看到，從2003年“非典”（非典型呼吸道綜合徵，由SARS冠狀病毒感染引起）暴發，到2012年“中東呼吸道綜合徵”（MERS病毒感染引起）出現, 再到2015年美洲寨卡病毒重現，以及從2018年開始，目前仍在非洲肆虐的埃博拉疫情（截至2019年10月7日，已有超過3000人感染，其中逾2000人死亡），還有當前正在對我國養豬業造成重創的非洲豬瘟病毒（2019年4月19日，全中國大陸31個省市自治區都傳出豬瘟疫情，非洲豬瘟傳染性強、病畜死亡幾乎達到100%）……我們很難預測下一次是什麼時候，什麼病毒會出現。這對傳染性疾病的監測以及疾病暴發後的應急響應機制提出了很高的要求。

2003年全球SARS病例分佈。得益於全球警報和患者隔離制度，全球SARS病例總數得以控制。 | 來源：https://www.nature.com/nature/focus/sars/map.html

開發低成本、高靈敏度且高特異性、高通量、方便攜帶、實時快速的檢測方法對於及時發現病原體是至關重要的。美國麻省理工學院的張鋒教授最近利用CRISPR技術開發的“SHOLCK”技術可以對1微升臨牀樣品在1小時內給出診斷結果，其靈敏度可達1拷貝，且成本約為0.6美金每個樣品。同時，加強廣譜抗病毒活性的藥物以及預防性疫苗的研發也是應對新發、突發病毒性疾病的有效手段，這就需要在基礎科研領域工作的病毒學家孜孜不倦地尋找病毒的“阿喀琉斯之踵”，找到以不變應萬變的策略。在2003暴發SARS之後，我國建立了完備的應對傳染病的國家突發公共事件應急響應機制，傳染病的防控能力大大增強。國家“傳染病防治”重大科技專項充分表明我國對傳染性疾病基礎研究的重視，可以為抵抗傳染性病原提供更多的理論研究。2018年，地處武漢的國家生物安全（四級）實驗室（簡稱“武漢P4實驗室”）正式投入運行，具備開展高致性病原微生物實驗室活動的資質，在國家公共衞生應急反應體系和生物防範體系中發揮着核心作用和生物安全平台支撐作用。

另外，我們也應該主動出擊，去了解病毒，預測病毒的流行。人類病毒組計劃（Global Virome Project）便是我們主動了解潛在病毒的策略，這項計劃旨在通過病毒檢測和樣品收集，一方面獲得“病毒生態學”大數據，包括宿主範圍、地理分佈和流行病學；另一方面通過測序病毒基因組獲得數據庫，建立一個綜合自然病毒生態學和遺傳學的病毒超級數據庫，以應對未來新發和再發病毒性傳染病的威脅。該計劃需要全球科學家的共同努力，合作描繪全球病毒譜。屆時，當遇到新發和再發病毒傳染病時，我們就可以像遇到生僻字去查字典一樣，迅速對病毒有所認識，做到“知己知彼，百戰不殆”。

以史為鑑，可以知興替。我們對過去總結得多深，可能決定我們將來能走多遠。在“西班牙流感”過去百年之際，科學普及出版社出版發行了《流感病毒：躲也躲不過的敵人》一書。這本書由中國科學院院士、中國疾病預防控制中心主任高福和中國科學院武漢病毒研究所劉歡博士擔任主編，以大家熟知的“流行性感冒“為切入點，以點帶面，介紹了流感病毒以及其他嚴重威脅人類公共健康的病毒。十個章節層層遞進，涉及到病毒性疾病發生、流行和控制、疫苗和抗病毒藥物研發、生命和演化、國際合作和中國發展以及現代科技與全球人類健康等話題，是一部普及科學精神，傳遞科學思想，人文精神的著作，推薦大家閲讀。

病毒性疾病的傳播不需要“簽證”，並沒有國界和地域的限制，傳染性疾病的控制不僅僅是政府的事情，也需要普通民眾、學術界、工業界和政府的廣泛參與，精誠合作。在傳染性疾病面前，所有的人類都是命運共同體。希望每個人讀完這本書後，在面臨新發和再發病毒性疾病的攻擊時，會多一些理性和思考，少一些不安和恐慌，並且能夠積極為戰勝病毒性傳染病儘自己的一份力量。

參考資料

[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Johan_Hultin

[2] Taubenberger, J. K., et al. (2007). “Discovery and characterization of the 1918 pandemic influenza virus in historical context.” Antivir Ther 12(4 Pt B): 581-591.[3] https://en.wikipedia.org/wiki/Jeffery_Taubenberger

[4] Taubenberger, J. K., et al. (1997). “Initial genetic characterization of the 1918 “Spanish” influenza virus.” Science 275(5307): 1793-1796.[5] Reid, A. H., et al. (1999). “Origin and evolution of the 1918 “Spanish” influenza virus hemagglutinin gene.” Proc Natl Acad Sci U S A 96(4): 1651-1656.

[6] Reid, A. H., et al. (2000). “Characterization of the 1918 “Spanish” influenza virus neuraminidase gene.” Proc Natl Acad Sci U S A 97(12): 6785-6790.

[7] Basler, C. F., et al. (2001). “Sequence of the 1918 pandemic influenza virus nonstructural gene (NS) segment and characterization of recombinant viruses bearing the 1918 NS genes.” Proc Natl Acad Sci U S A 98(5): 2746-2751.

[8] Reid, A. H., et al. (2002). “Characterization of the 1918 “Spanish” influenza virus matrix gene segment.” J Virol 76(21): 10717-10723.

[9] Reid, A. H., et al. (2004). “Novel origin of the 1918 pandemic influenza virus nucleoprotein gene.” J Virol 78(22): 12462-12470.

[10] Taubenberger, J. K., et al. (2005). “Characterization of the 1918 influenza virus polymerase genes.” Nature 437(7060): 889-893.參考文獻[4-10] Taubenberger博士團隊分別將1918年流感病毒的基因進行測序

[11] Worobey, M., et al. (2014). “Genesis and pathogenesis of the 1918 pandemic H1N1 influenza A virus.” Proc Natl Acad Sci U S A 111(22): 8107-8112.

[12] Luytjes, W., et al. (1989). “Amplification, expression, and packaging of foreign gene by influenza virus.” Cell 59(6): 1107-1113.

[13] Fodor, E., et al. (1999). “Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.” J Virol 73(11): 9679-9682.

[14] Neumann, G., et al. (1999). “Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.” Proc Natl Acad Sci U S A 96(16): 9345-9350.參考文章12-14：報道流感病毒反向遺傳學操作系統

[15] Tumpey, T. M., et al. (2005). “Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus.” Science 310(5745): 77-80.參考文獻15：復活1918年流感病毒，並研究其致病性以及致病機制

[16] Kash, J. C., et al. (2006). “Genomic analysis of increased host immune and cell death responses induced by 1918 influenza virus.” Nature 443(7111): 578-581.參考文獻16: 發現1918年流感病毒可引起宿主過強的免疫應答

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