從試劑盒到實驗室 盤點一下影響確診人數的客觀因素_風聞

本文轉自微信公眾號“科學大院”，作者：朱光平

新型肺炎確診人數每天牽動着大家的情緒變化。牽掛之餘，大家對於這個數字一定有着很多疑問：確診到底需要經過哪些步驟？前期確診速度為何那麼慢？如今確診速度為何陡然上升？

騰訊新聞疫情地圖截圖（截止1月30日）

其實，新型冠狀病毒肺炎的確診並不如我們想的那樣簡單，影響它的客觀因素很多，主要有兩大方面的原因：一個是試驗因素的影響，另一個我概括為非試驗因素。

試驗因素

1.確診，就是做PCR

PCR的原理是大量擴增微量的遺傳物質。

首先，我們要明白什麼是遺傳物質。簡單地説，遺傳物質是從父母那裏得到的，決定了我們的外在特徵，比如我們的眼睛是大是小，臉是圓是方。而一般生物體的遺傳物質分為兩種，一種名字叫DNA，一種叫RNA。大多數生物體的遺傳物質都是DNA，只有極少數病毒的遺傳物質是RNA。DNA具有雙螺旋結構，而RNA是單鏈結構，打個比方，DNA就好似兩股擰在一起的繩子，而RNA就是一股繩子。所以DNA相比於RNA具有更加穩定，更加堅固的結構。但單股繩子使用起來更加靈活多變。所以，某些遺傳物質是RNA的病毒傳染性強，適應性極高，例如2003年的SARS冠狀病毒和這次的新型冠狀病毒。

（圖片來源：veer圖庫）

針對這次新型冠狀病毒的檢測，我們最主要的方法還是檢測人身上（痰液、血液、肺泡灌洗液）是否存在病毒的遺傳物質，從而確診其是否被病毒感染。但單鏈的RNA十分脆弱，容易斷裂和降解。所以我們通過一種方法（反轉錄）將單鏈RNA先變成單鏈DNA，而後變成雙鏈的DNA，讓它們在檢測過程中可以穩定長期的存在。

**但是極其微量的遺傳物質，很難被檢測到。所以科研人員又想辦法讓極其微量的DNA成倍成倍的增加，這就是我們説的PCR過程。**其實這個過程就好比，給了你磚（原材料，代指四種鹼基）和石灰（粘合劑，這裏代指DNA聚合酶），讓你蓋幾棟結構一樣的房子一樣，只要原材料夠，數量就不在話下。當數量上來以後，我們再看這個結構和磚塊的排列方式（代指四種鹼基的排列方式）是否和病毒的遺傳物質排列順序一樣，如果一樣的話，就代表病人是攜帶病毒的。

PCR基本原理圖（圖片來源：http://cache1.bioon.com.cn/）

PCR技術的設想在1983年由美國科學家凱利▪穆利斯（Kary Mullis）提出，1985年開始被應用於研究研究、醫學診斷和法醫鑑定等多個領域。後來很多科研人員在PCR的基礎上開發了優化升級版的PCR技術，比如1996年出現的熒光PCR技術[1]。實現了遺傳物質的實時定量，**這就好比可以實際監測你在蓋房子的時候蓋了多少了。**在儀器的監測下，我們可以計算從人身上取得的樣本（唾液、血液和肺泡灌洗液）中的初始病毒遺傳物質的含量，從而判斷病人是否攜帶病毒。熒光PCR技術目前已經成為病毒核酸檢測的一種常規方法。

新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒主要就是通過熒光PCR技術，檢測來自病人或疑似病人的咽拭子、血液、肺泡灌洗液等樣本中的病毒遺傳物質的含量，如果核酸含量超過某個臨界值即為陽性結果，則認為該病人被新型冠狀病毒感染；如果樣本中的核酸含量低於某個臨界值即陰性結果，則認為該病人未被新型冠狀病毒感染[2]。

2.有了試劑盒，才能快速確診

 新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒（圖片來源：今日頭條）

要對新型冠狀病毒進行PCR檢測，我們首先還要獲得新型冠狀病毒遺傳物質RNA的全基因組序列。簡單的來講，RNA並不是純粹的就是一股繩子，而是有“一包”。並且RNA是由四種原材料（即四種鹼基）按照特定的順序排列，**全基因組測序就是將這“一包”遺傳物質的排列順序摸清楚，這樣我們“蓋房子”才有參考對象，也才能知道我們蓋出來的房子是不是和我們想的一樣。**俗話説“萬事開頭難”，所以在PCR複製擴增的時候，我們會人為幫助開個頭，這個頭兒的名字叫做“引物”（引物也是一小段遺傳物質DNA，它們在粘合劑的輔助下可以幫助PCR過程迅速啓動）和“熒光探針”。熒光探針與引物的作用類似，是PCR儀對遺傳物質複製擴增“監控”的“攝像頭”。值得注意的是，引物和熒光探針的設計與合成一定要參考遺傳物質的原有序列，並不是隨便什麼都可以。

試劑盒就是將PCR複製擴增時候需要用到的各種原料提前配置好，之後醫務人員在進行確診的時候可以大大節省配置的時間。當然，試劑盒使用的條件（温度、時間等）也是需要開發人員去探究和摸索的，要不斷的進行優化、測試和驗證，以此確保試劑盒的準確性和精確性，避免出現誤診和漏診（假陽性和假陰性）的情況，隨後便可獲得用於臨牀診斷的標準化新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒。

讓我們來回顧一下新型冠狀病毒檢測試劑盒的發展情況：

2020年1月7日，實驗室檢出一種新型冠狀病毒。

2020年1月10日，多家研究機構聯合完成了病原核酸檢測，實驗室人員獲得病毒全基因組序列。通過對病毒基因組序列分析，是一種新型的冠狀病毒。

2020年1月11日，國內多家上市公司獲得病毒的基因序列，並各自隨即啓動快速檢測試劑盒的研發。

2020年1月13日-14日，多家公司研發出核酸檢測試劑盒。科華生物最早開始組織規模化的生產。

2020年1月16日，國家疾控中心向全國20多個地市下發快速診斷檢測試劑盒。由此各地醫院才真正具有了大批量同時快速檢測手段。

隨後，三家已經通過國家疾控中心認證的試劑盒生產企業迅速投入生產，僅捷諾生物一家公司在1月16日生產了可供7.5萬人使用的試劑盒。而1月25日，已有7家企業研發的新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒進入國家藥監局的應急審批通道。伯傑醫療、捷諾生物和輝睿生物是國家衞健委確認的3家供應商。1月26日晚，之江生物、捷諾生物、華大基因和華大智造共四個產品已經獲批。而截至1月28日又有兩家企業（達安基因、聖湘生物）兩個核酸病毒檢測試劑盒獲批。

新型冠狀病毒試劑盒正式獲批直供醫院，使確診時間大大縮短，最短僅需兩個小時。試劑盒的快速生產為新型冠狀病毒的確診提供了必要條件，近兩日，確診病例呈指數增加也都是在意料之中。

之江生物新冠病毒檢測試劑盒獲批證書

非試驗因素

16號就有了試劑盒，為什麼到了22號之後確診人數才開始大幅增加呢？因為還有幾個非試驗因素。

1.必要的流程

根據1月18日衞健委新修訂的《全國各省（區、式）首例新型冠狀病毒感染的肺炎病例確認程序》，對於武漢之外的其他省市，審核不僅要經過省一級，還要上報國家，並由專家小組評估，三輪都確認，才能確診。1月23日武漢市衞健委曾表示，前期（1月16日後）對疑似病例樣本檢測流程是：首診醫院通過規範的預檢分診，結合臨牀檢查、實驗室檢查和胸部影像檢查；經專家組會診後確認疑似病例並採樣，由轄區疾控中心將樣本轉運到市疾控中；市疾控中心轉運到省疾控中心，進行核酸檢測。每天省疾控中心可檢測樣本200多份，從採樣開始到結果返回，大約需要2-3天。26日之江生物等四個產品獲批後，新型冠狀病毒檢測試劑盒可以直供醫院，確診時間方能大大縮減。

2.檢測要素：實驗室、儀器、人員

由於疑似病例較多，所以保質保量的確診速度，需要足夠多的醫務人員，符合檢測條件的實驗室，還有足夠的實驗儀器。

首先説一下做熒光PCR之前，醫務人員需要做哪些準備工作。一、從病人身上採樣，即收集病人的咽拭子、血液和肺泡灌洗液等。由於病人具有傳染性，所以在取之前，醫務人員還需要時間做好防護工作；二、從樣本中提取病毒的遺傳物質，一次可提取大概32到96個樣本，每次提取時間在0.5-2個小時之間；三、加樣，就是將PCR擴增需要的模板（提取的病毒遺傳物質）、原料（四種鹼基）、酶（即前面説的粘合劑，DNA聚合酶）按照一定的比例加在一個試管裏；四、上儀器（熒光PCR儀器），一般一個程序運行需要1.5-2個小時左右。一般一台熒光PCR儀器一次最多可以檢測96-384個樣本。這還不算上平行樣本（重複實驗，提高準確性），加上試劑的準備和上樣等操作時間，一輪熒光PCR檢測需要4-5個小時，當然結果分析和出檢測報告的時間還要另算。

**其次，**由於新型冠狀病毒屬於強傳染性的病毒，所以為了防止在檢測過程中相關人員的感染，並不是所有的醫務人員都可以參與檢測工作，他們必須經過專業訓練的檢測員。當然，由於中央的調控，全國的醫務人員對重災區武漢的大力支持，醫務人員是否足夠已不是一件緊迫的事情。

**最後，**即使人員和儀器都到位了，也並不是所有的實驗室都可以承擔檢測工作。像新型冠狀病毒這類核酸病毒檢測的實驗室必須達到至少二級生物安全實驗室級別，同時採用生物安全三級實驗室的個人防護[3]，才能開展相應的檢測。

因此，熒光PCR儀器的數量、符合條件的實驗室數量、操作人員的數量成為決定新型冠狀病毒核酸檢測效率的重要影響因素。經過中央的緊急調控，近日湖北幾個重大疫區的檢測效率已大大提高。

結語

總之，新型冠狀病毒的確診並不如我們想象的那麼簡單，必須要走的流程讓病毒檢測更加嚴謹，更加科學。試劑盒的快速生產、迅速獲批，最優的實驗條件，以及國家的宏觀調控，全國人民的努力為這次疫情的勝利提供了必要的條件。值得高興的是，新型冠狀病毒的檢測試劑盒也正在以非常快的速度優化，確診時間已在不斷縮短，醫護人員也在全力救治，疫苗的研發也緊跟其後。面對疫情，讓我們共同努力，期待勝利的到來！

參考文獻:

[1] 劉姍姍, 嶽素文, 江洪, et al. PCR的優化與發展[J]. 臨牀檢驗雜誌(電子版), 2014, 3(2):610-617.

[2] 武漢新型冠狀病毒肺炎確診，到底難在哪兒https://mp.weixin.qq.com/s/XIbJImyqWCU9O5p7c_eEzQ

[3] 生物實驗室等級劃分標準 http://www.sohu.com/a/255266393_346845

供稿單位：中國科學院上海巴斯德研究所