mRNA療法——疫苗通向未來的大門_風聞

來源 | 藥渡（Pharmacodia）

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本文首發於2018-01-16。

本月4號，總部位於德國美因茨的生物技術公司BioNTech完成了2.7億美元的“A輪”融資，旨在滿足其龐大生產業務的快速增長。作為E11評為最有潛力的公司之一（勢如破竹，孤注一擲——南京傳奇生物等榮登E11榜單），BioNTech公司最主要的關注領域就是個體化的mRNA療法。

過去的半年，先後有多項關於mRNA技術的交易完成。10月，禮來與CureVac公司簽署了一項價值18億美元的鉅額交易，將共同開發了5種新型mRNA癌症疫苗；11月，CRISPR Therapeutics宣佈投資CureVac開發Cas9 mRNA用於體內基因編輯。另一家mRNA研究公司Moderna也得到了大量投資者支持，開啓了針對個性化癌症疫苗mRNA-4157的臨牀研究。

投資者高漲的熱情表明mRNA療法這個並不算新的技術(上世紀90年代已完成概念驗證)，**隨着技術的發展提高了其安全有效性，正進入新一輪的爆發期。**目前mRNA藥物研發基本呈現三足鼎立的態勢(圖1)。BioNTech、CureVac AG和Moderna三家公司佔據了絕大部分在研管線。場上還有一些其他的公司和研究機構，也在努力發展自己的產品。

圖1.主要mRNA疫苗研發公司及機構一覽

mRNA疫苗是什麼？

1990年，科學家將體外轉錄的信使RNA—mRNA注射入小鼠體內，通過檢測發現其可在小鼠體內表達活性，產生相關蛋白且具有劑量依賴性。這種直接注射mRNA的方法能夠通過表達特定蛋白，產生免疫反應，這就是mRNA療法的雛形。

在隨後的研究中，雖然動物實驗表明了mRNA可以發揮類似疫苗的作用，達到治療目的。但是受當時技術限制，在mRNA穩定性，藥物遞送，還有安全性等方面存在瓶頸，這種療法逐漸趨冷，更多研究者轉向DNA和替代蛋白領域。

時間進入21世紀，mRNA合成、修飾技術和遞送技術的發展讓mRNA療法重返生物製藥公司的視線。相比傳統疫苗，mRNA的安全性更有優勢，不會插入基因突變，可以被正常細胞降解，通過調節序列修飾和遞送載體可以改變其半衰期等(圖2)。更重要的是，傳統疫苗對很多新型病毒有心無力，更別提像癌症這種嚴重威脅人類健康的疾病了。而mRNA的作用機理使它就像一本餐譜一樣，只要你編好RNA序列，就可以將細胞變成小型的藥物工廠，mRNA引導細胞自己產生特定蛋白髮揮系統藥效。

圖2.傳統疫苗、DNA疫苗和mRNA疫苗的若干區別

mRNA疫苗靠什麼？

作用機理

mRNA參與DNA翻譯和蛋白質生成的中間步驟。目前用於製造疫苗的有兩種RNA，非複製型(non-replicating) mRNA和自我擴增型(self-amplifying) mRNA。傳統mRNA疫苗編碼的抗原包含5ʹ和3ʹ的未翻譯區(UTRs)，而自我擴增型RNA不僅能編碼抗原，還有類似病毒複製過程的序列，使其可以在細胞內複製，提高蛋白表達量。

簡單的説，體外轉錄RNA利用DNA模板和RNA聚合酶，包括T7、T3或Sp6噬菌體聚合酶，來製備具有蛋白質編碼功能的開放閲讀框(open reading frame)。這個閲讀框兩個重要組成部分分別是一個5’端的“帽子”結構和一條多聚A (poly A)的”尾巴“。除此之外，還有一段未翻譯區，它可以提高複合物在轉錄時的穩定性，使人工製造的mRNA可以像成熟mRNA分子一樣發揮轉錄組裝作用。裸露的mRNA很容易被胞外核糖核酸酶催化降解，因此很多載體被用於提高mRNA攝取。一旦mRNA進入胞漿，細胞翻譯機制就能在其引導下組裝氨基酸序列，進行翻譯後修飾並恰當的摺疊形成功能性蛋白質。mRNA的這些藥理特性使其在疫苗療法領域具有無可比擬的優勢。

新的技術

近年來，不同的mRNA疫苗平台在免疫原性和藥效方面均取得巨大進展。RNA序列工程技術使得人工合成的mRNA比以前的翻譯功能更好，高效低毒的載體能夠顯著提高抗原的體內表達，一些疫苗中還加入了新型佐劑。

1.對mRNA翻譯和穩定性的優化

現有的mRNA修飾技術能夠直接或間接的影響免疫應答，主要包括：合成”帽子“類似結構；在5’和3’ UTR區域增加可調控序列；修飾多聚A“尾巴”。這其中5’和3’ UTR區域序列的改進對於提高mRNA穩定性和蛋白表達至關重要，選擇與tRNA同源的密碼子可以提高mRNA的翻譯能力。在生產中還可以利用分離和純化技術來優化mRNA。

2.免疫原性的調節

圖3中展示了樹突細胞(dendritic cell, DC)對兩種mRNA疫苗的免疫應答。外源mRNA能在體內產生免疫刺激，因為它能被細胞表面、核內體或胞質的免疫應答受體識別。**根據治療方法不同，這種免疫刺激也是有利有弊。有利的一面是它能夠驅動DC成熟因子，進而激發T細胞和B細胞產生強烈的免疫應答。弊的一面是這種免疫感應也可能抑制抗原的表達，對免疫應答產生消極作用。**其背後複雜機理尚不十分清楚，但是近些年相關研究也取得了一些進展。

圖3.mRNA疫苗觸發免疫應答過程，黃色基團代表RNA感應器，紅色基團代表抗原，綠色基團代表DC成熟因子，紅藍色基團代表主要組織相容性複合體(MHC)，圖片右上方一個脂質納米粒載體 (圖片引自參考文獻2)

研究發現mRNA的這種免疫刺激可以通過製備純化，引入修飾性核苷，或者通過改變載體分子來改善。生產mRNA疫苗過程中的酶促反應會生成一些雙鍵RNA的副產物，因為與病毒基因組和複製中間產物類似，雙鍵RNA是一個潛在的病原體相關分子(PAMP)，能夠被很多細胞區室受體感應產生應激反應，最終導致翻譯抑制和mRNA降解。用分析手段，對製備的mRNA進行純化，可以減少雙鏈副產物，防止不必要的免疫刺激。除了雙鏈RNA雜質的影響，單鏈RNA本身也是一種PAMP，能夠引起I型干擾素產生，通過引入自然核苷可以減少其產生，這些結果表明似乎經過純化和修飾的mRNA在樹突細胞中可明顯提高蛋白表達量。但是也有研究表明，經過純化，未修飾的mRNA能夠在HeLa細胞中產生比修飾過的mRNA更多的蛋白質，這與上面的結果是相反的。結論就是不論是採用純化還是修飾，都要根據靶點細胞不同而採用不同的組合策略和調控技術，只有這樣才能發揮最好的藥效。

3.mRNA遞送方式的進展

上文提到過，裸露的mRNA直接進入體內會被降解，因此高效的mRNA遞送是疫苗藥效的保證。目前利用載體和直接注入這兩種mRNA遞送方式都在生產中使用。

利用載體將mRNA注入體內

常用載體包括樹突細胞，魚精蛋白，微質粒載體和高分子載體等。樹突細胞是免疫系統最有潛力的抗原表達細胞。陽離子多肽魚精蛋白已被證實可以保護mRNA免於被核糖核苷酶降解。但是同時也有數據表明它會降低蛋白的表達，這可能是由於mRNA和魚精蛋白連接過於緊密造成的。陽離子脂質體和高分子，如樹枝狀高分子，已經在過去幾年的mRNA給藥途徑中廣泛運用，這也是借了小干擾RNA (siRNA)領域發展的東風。脂質納米粒(LNPs)載體已經變成了mRNA疫苗最常用的載體之一。

直接將mRNA注入體內

常用皮內注射或節內注射方法，有報道稱重複節內接種mRNA，由腫瘤相關的抗原來激發T細胞應答，可以提高患者的無進展生存期(PFS)。

物理遞送方法

除了以上兩種方法，還有使用物理方法mRNA的細胞膜穿透。比如電基因槍、電穿孔法等。物理方法的缺點是可能會引起細胞死亡。

mRNA疫苗能帶來什麼？

mRNA疫苗目前有兩大應用領域，傳染性疾病和癌症(圖4)。需要注意的是mRNA給藥後的生物分佈。比如裝載mRNA的脂質納米粒，靜脈給藥後主要分佈在肝臟，這對於樹突細胞的活化並不是最理想的。影響給藥後生物分佈的因素有載體與mRNA的比例，淨電荷等。比如帶正電荷的納米粒主要靶向肺部，而帶負電荷則主要靶向次級淋巴組織和骨髓。

圖4.目前處於臨牀研究階段的mRNA疫苗疾病分佈

抗傳染病的mRNA疫苗

發展預防性或治療性疫苗來對抗傳染性病原體，是遏制和預防流行病是最有效的手段。但是，過去的疫苗產品不能對抗像HIV、皰疹病毒或是呼吸道合胞病毒這些對人類健康造成巨大危害的病毒。除此之外，像2014-2016年先後爆發的埃博拉病毒和塞卡病毒這類突發病毒疾病，傳統疫苗也排不上用場。因此，發展更有效的疫苗刻不容緩。

無數臨牀前的動物實驗已經證明了mRNA疫苗對抗傳染性病毒的藥效。動物實驗中安全性良好，其快速製備的特點也適用於傳染病爆發的靈活應對，相對簡單的生產工藝也便於質量控制。與蛋白免疫接種不同，mRNA疫苗能夠引起強烈的CD4+或CD8+ 的T細胞應答。它們也與DNA免疫接種不同，在動物體內mRNA疫苗通過一兩次低劑量接種就能夠產生抗體。目前臨牀階段開發的mRNA疫苗針對疾病包括HIV，流感病毒和狂犬病毒等。

抗腫瘤的mRNA疫苗

腫瘤疫苗和其他免疫療法被認為是非常有前途的治療惡性腫瘤的方法。腫瘤疫苗可以設計成靶向腫瘤細胞選擇表達的相關抗原，比如，生長因子等。也可以靶向惡性腫瘤細胞突變產生的特有抗原。針對癌症的mRNA疫苗一般起治療作用，而不是傳統的預防作用，目的是促使細胞介導的應答，比如典型的T淋巴細胞應答，從而達到清除或者減少腫瘤細胞的目的，部分研發管線見圖5。

1.以樹突細胞為載體的mRNA腫瘤疫苗

從1996年研究人員通過實驗證明樹突細胞裝載mRNA可以激發腫瘤抗原產生免疫應答起，到今天，相關臨牀研究已涵蓋轉移性前列腺癌、肺癌、腎細胞癌、腦癌、黑色素瘤、急性髓性白血病和胰腺癌等。現在研究人員還將樹突細胞載mRNA疫苗與傳統化療藥物或者免疫檢查點抑制劑聯用，其中的一項臨牀試驗中，III-IV期黑色素瘤患者同時給予單克隆抗體Ipilimumab和載有黑色素瘤抗原相關mRNA的樹突細胞注射劑，結果表明該療法可以持續降低部分複發性或難治性黑色素瘤患者的腫瘤。

圖5.BioNTech，CureVac AG和Moderna三家公司部分mRNA研發管線(來自公司官網)

2.直接注射的mRNA腫瘤疫苗

直接注射的給藥途徑包括皮內注射，肌肉注射，皮下注射和鼻內給藥，還有一些非傳統方式包括節內注射，靜脈給藥，經脾給藥和腫瘤給藥。不同的給藥方式對於mRNA疫苗的藥效有很大影響，總體來講，由於裸露的mRNA易於降解，存在血清蛋白聚合，所以直接注射法並不常用。

mRNA疫苗的挑戰與展望

另一種聲音

關於mRNA疫苗副作用的聲音一刻也沒有停止過，雖然目前臨牀研究大都沒有問題，但是確實也有一些副反應的例子出現，甚至包括一些嚴重的副作用，引起注射部位或全身反應。**因此在相關臨牀試驗中要格外注意像局部和全身炎症、藥物的生物分佈、免疫原的持續表達、刺激抗體的自激活，還有非原生核苷酸及載體引入的成分所具有的潛在毒性等。**一部分研究者認為mRNA疫苗能夠引起I型干擾素反應，不僅會引起炎症，還可能與自身免疫相關。另一個潛在風險是胞外RNA的引入，其能夠增加內皮細胞的滲透性導致水腫；還能引起血液凝固和病理性血栓形成。因此在將mRNA疫苗用於人體或是開展大規模臨牀研究前，一定要進行嚴格的安全性評價。

**除了潛在的副作用，一些臨牀研究結果還證明mRNA疫苗在人體中的藥效比動物體內低的多。**雖然這不是一個普遍存在的現象，但是也給研究人員提了醒，需要進一步研究動物與人對mRNA疫苗的應答差異，到底人體中哪條免疫通路最有效的？是否可以通過改變疫苗的免疫刺激表達來改善藥效？這些都是需要解決的問題。

結論

當下的mRNA療法真的可以用炙手可熱來形容。早期臨牀前的大量研究數據為這一領域做足了鋪墊。除了在流感、塞卡病毒和癌症治療方面大放異彩，最近的研究還發現mRNA能夠激活被動免疫功能。但是任何一項新技術，捧得太高終歸不是一件好事情，人體藥效的驗證和臨牀副作用，任何一點得不到很好的解決都會讓mRNA疫苗跌下神壇。mRNA療法到底是”未來疫苗的大門“，還是”皇帝的新衣“？且讓我們拭目以待。

參考文獻：

1.mRNA疫苗研究進展及挑戰，免疫學雜誌。

2.mRNA vaccines——a new era in vaccinology, Nature Reviews.

3.BioNTech raises mammoth $270M A round, nearing $1B mark as investors continue a love affair with mRNA. Endpoints.

4.mRNA Vaccines: Disruptive Innovation in Vaccination.