2020年4月CRISPR/Cas最新研究進展_風聞
源井生物-让基因编辑更简单！2020-04-30 09:49
基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短迴文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。
2018年11月26日，中國科學家賀建奎聲稱世界上首批經過基因編輯的嬰兒---一對雙胞胎女性嬰兒---在11月出生。他利用一種強大的基因編輯工具CRISPR-Cas9對這對雙胞胎的一個基因進行修改，使得她們出生後就能夠天然地抵抗HIV感染。這也是世界首例免疫艾滋病基因編輯嬰兒。這條消息瞬間在國內外網站上迅速發酵，引發千層浪。有部分科學家支持賀建奎的研究，但是更多的是質疑，甚至是譴責。
即將過去的4月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閲讀。
1.Cell：開發出利用CRISPR抵抗流感病毒和SARS-CoV-2的新型抗****病毒策略
doi:10.1016/j.cell.2020.04.020
雖然大多數正在進行的疫苗臨牀試驗通過誘導人類免疫系統識別冠狀病毒蛋白或減毒病毒並減少病毒進入細胞來發揮作用，但是，在一項新的研究中，來自美國斯坦福大學等多家研究機構的研究人員提出一種替代性抗病毒方法，它依賴於一種基於CRISPR的系統，用於識別和降解細胞內病毒基因組及其產生的病毒mRNA（圖1B）。靶向正義基因組和病毒mRNA以同時降解用於病毒複製和基因表達的病毒基因組模板，這將有望穩健地限制病毒複製。相關研究結果以論文手稿的形式在線發表在Cell期刊上，論文標題為“Development of CRISPR as an antiviral strategy to combat SARS-CoV-2 and influenza”。
在這項新的研究中，這些研究人員在人細胞中開發出一種預防性抗病毒CRISPR策略（Prophylactic Antiviral CRISPR in huMAN cells，簡稱PAC-MAN）。作為一種基因干預的形式，PAC-MAN靶向SARS-CoV-2和IAV，並且可能靶向所有冠狀病毒。他們構建出一種生物信息學管道，在許多測序的SARS-CoV-2基因組中確定高度保守的區域，並利用CRISPR-Cas13d靶向這些保守性區域以進行病毒序列降解。
這些研究人員證實這種方法能夠切割SARS-CoV-2片段，並減少人肺上皮細胞中的病毒RNA數量。他們的生物信息學分析揭示出6個crRNA能夠靶向91%的已被測序的冠狀病毒，以及22個crRNA能夠靶向所有已被測序的冠狀病毒。通過使用靶向同一病毒的不同區域或者不同冠狀病毒毒株的crRNA文庫，這種方法可能會對沖病毒進化和逃逸，也可能用來抵禦未來出現的相關致病病毒。雖然這一策略在臨牀上應用之前還有一些障礙需要克服，但PAC-MAN有可能成為一種新的抗病毒策略。
doi:10.1038/s41551-020-0546-5
日前，一項刊登在國際雜誌Nature Biomedical Engineering上題為“A CRISPR-based assay for the detection of opportunistic infections post-transplantation and for the monitoring of transplant rejection”的研究報告中，來自麻省理工學院等機構的科學家們通過研究基於CRISPR開發出了一種新型診斷技術來檢測器官移植後患者的感染風險，同時監測患者對移植器官的排斥反應。
在器官移植過程中，感染和排斥是引發移植失敗的主要原因，其是通過免疫抑制的狀態聯繫到一起的，為了能夠儘可能早地診斷並且治療這些情況，並改善患者的長期預後，研究人員就需要對接受器官移植的患者進行持續性監測；這項研究中，研究人員基於CRISPR–Cas13開發出了一種快速廉價的檢測方法，其能準確檢測來自病人機體血液和尿液樣本中BK多瘤病毒（BKV）和鉅細胞病毒（CMV）的DNA，以及經歷急性腎移植排斥反應患者尿液中水平升高的CXCL9 mRNA（移植物排斥的標誌物）；BKV、CMV和CXCL9 mRNA在急性細胞腎移植排斥反應中的表達水平會升高。
這項研究中，研究人員CRISPR–Cas13技術開發出了一種檢測試劑盒，在對100多名感染BKV和CMV的患者的臨牀樣本在不同病毒載量範圍內進行檢測後，研究者發現了這種檢測手段具有較高的診斷效率；這種試劑盒能夠使用兩步法，首先其能對尿液樣本中的病毒靶向DNA進行擴增，以便於僅有單分子存在的情況下CRISPR也能檢測到靶標；隨後研究人員使用了一種稱之為SHERLOCK的特殊CRISPR–Cas13步驟來優化病毒DNA的檢測過程，檢測過程就好像使用一般的測孕試紙海洋，當將檢測試劑條浸潤到樣本中時，如果檢測條出現一條線就表明結果是陰性，如果是兩條線就證明存在病毒感染。此外，研究人員還利用試劑盒對排斥標誌物CXCL9進行檢測，作為mRNA，其能被分離並且擴增，隨後利用CRISPR-Cas13對其進行靶點檢測。對於非常低的目標濃度，檢測試紙條也會出現不能確定的第二條條帶，這或許就會導致研究人員對結果產生誤判，基於此，研究人員開發出了一款智能手機app，其能客觀地分析試紙條帶的結果，並給出準確的結果判讀。
快速有效的POCT（即時檢測）技術能幫助患者在資源匱乏的環境中進行疾病的早期診斷成為可能，同時還能幫助患者實現疾病的自我監測，這項研究中，研究人員基於CRISPR-Cas13開發的新型診斷試劑盒就能對器官移植受體患者樣本中的CMV和BKV進行檢測，同時研究者還運用SHERLOCK步驟成功實現了對患者樣本中CXCL9 mRNA的檢測；這種新型工具或有望作為器官移植患者移植後發現進行早期排斥反應和監測的工具。
3.Cell綜述深度解讀！基於CRISPR治療性基因編輯領域的研究現狀及未來展望！
doi:10.1016/j.cell.2020.03.023
日前，一項刊登在國際雜誌Cell上題為“CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing：Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors”的綜述文章中，來自馬賽諸塞大學醫學院等機構的科學家們描述了以CRISPR為基礎的改善人類健康的策略，其重點是通過利用AAV載體將CRISPR療法直接導入人體，此外，研究人員還討論了目前廣泛應用基於CRISPR療法所要面臨的挑戰，並強調了持續的研究和技術革新對於推動基於CRISPR療法在人類疾病研究中的重要性。
4.Cell：利用CRISPR-CasRx技術將神經膠質細胞轉換為神經元或有望減緩神經性疾病的症狀
doi:10.1016/j.cell.2020.03.024
日前，一項刊登在國際雜誌Cell上題為“Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice”的研究報告中，來自中科院上海生命科學研究院等機構的科學家們通過研究發現，利用CRISPR-CasRx技術將神經膠質細胞轉換為神經元細胞，或能有效減緩小鼠機體神經性疾病的症狀。
這項研究中，研究人員指出，利用體內病毒遞送的RNA靶向CRISPR-CasRx技術來下調單一RNA結合蛋白—Ptbp1（多聚嘧啶序列結合蛋白1）或能導致Muller膠質細胞高效轉化為視網膜神經節細胞（RGCs，retinal ganglion cells），從而就能減緩與RGC缺失相關的疾病症狀。
本文研究的主要結果包括：1）敲除Ptbp1或能將Muller膠質細胞轉化為成熟視網膜組織中的視網膜神經節細胞；2）轉化後的視網膜神經節細胞的中央投射或會恢復機體的視覺反應；3）在帕金森小鼠模型中揭示了具有多巴胺能特徵的神經元誘導特性；4）誘導的神經元或能減緩帕金森小鼠機體的運動功能障礙。
研究者表示，這種方法還能誘導大腦紋狀體中產生具有多巴胺能特性的神經元，同時還會減緩帕金森疾病小鼠模型機體中的運動缺陷；因此，基於CRISPR-CasRx技術所介導的Ptbp1基因敲除所引發的膠質細胞向神經元細胞的轉換或能在體內作為一種遺傳性手段來幫助治療因神經元功能缺失所引發的一系列神經性障礙。
5.Nat Biotechnol：開發出能同時對多個基因組位點進行編輯的超強基因編輯工具—CHyMErA
doi:10.1038/s41587-020-0437-z
近日，一項刊登在國際雜誌Nature
Biotechnology上的研究報告中，來自多倫多大學等機構的科學家們通過研究開發了一種新技術能同時對基因組中多個位點進行編輯，從而就有望幫助研究不同DNA的組合與人類健康和疾病的關聯。基於CRISPR的DNA編輯技術能通過對任何人類基因進行精確剔除來研究其功能，從而就能徹底改變科學家們對人類基因組的研究，但目前研究人員仍然面臨眾多挑戰，比如如何在相同細胞中同時移除多個基因或基因片段，這種類型的基因組“手術”對於科學家們而言，瞭解基因組不同部分在正常生理和疾病狀況下是如何協同發揮作用的似乎更為重要。
如今研究人員開發了一種名為CHyMErA（Cas Hybrid for Multiplexed Editing and Screening applications）的新技術，其能應用到任何哺乳動物細胞中，同時系統性地靶向作用多個位點的DNA片段，CRISPR剪刀能通過導向RNA分子將DNA切割酶運送到基因組上的預想位點中，而使用最為廣泛的DNA切割酶就是Cas9酶，自Cas9問世以來，科學家們一直尋找其它具有獨特特性的Cas酶，以尋求改進和擴展該技術的應用；與CRISPR-Cas9技術不同的是，ChyMErA技術能將Cas9和Cas12a兩種不同的DNA切割酶進行結合，從而實現多種用途，Cas12a酶是一種能用來在相同細胞中產生多個導向RNA分子的關鍵酶類，而這是同時進行DNA編輯的關鍵。
研究者Thomas
Gonatopoulos-Pournatzis表示，我們花費了多年來開發能同時檢測Cas9和Cas12a酶的組合性基因編輯技術，隨後我們將這些酶類進行結合開發出了ChyMErA系統；研究人員嘗試了多種方法來誘導基因片段缺失，但並沒有哪一種手段會比ChyMErA更加有效；研究者發現，ChyMErA能夠成功剔除基因片段，隨後研究者在大規模篩查中利用該技術來系統性地分析基因如何進行結合來發揮作用。在ChyMErA技術的幫助下，研究人員就能夠使用兩種酶中最好的酶類來進行基因編輯，Cas9已經被廣泛改進擁有較高的編輯效率，而Cas12a則能允許多種導向RNAs的使用，因此其在尋找能在基因組中進行位點切割上具有更大的靈活性。
6.Nature子刊重大突破：納米顆粒實現器官特異性基因編輯！
doi:10.1038/s41565-020-0669-6
在最新一期Nature Nanotechnology上，Qiang Cheng等人提出了一種稱為選擇性器官靶向(SORT)的方法，通過生物工程將含有核酸療法的LNPs誘導肝臟、脾臟和肺特異性基因調控。LNP系統通常由磷脂、膽固醇、聚乙二醇(PEG)脂質和可電離的陽離子脂質組成。每個LNP成分及其摩爾比都已被優化，以確保高效的核酸遞送到肝細胞。特別是，合理設計和篩選可電離的陽離子脂質(或類脂質)文庫對於實現臨牀應用相關劑量的肝基因沉默至關重要。最有效的電離陽離子脂質，其特徵是明顯的pKa值在6.2和6.5之間，具有三種功能：(1)在LNP生產期間，酸性pH值下質子化的叔胺脂質頭部促進其與帶負電荷的核酸結合，(2)在生理的pH值，附近無電荷的脂質確保淨中性表面電荷，以減少免疫反應和循環時間延長和(3)細胞攝取後進入酸化的內體中，正電荷脂質促進膜融合和有效的胞質遞送。
在這種SORT方法中，作者添加五分之一脂質成分來通過靜脈注射遞送功能信使核糖核酸或基因編輯複合物道特定組織。使用一個快速的混合過程，這種SORT脂質
(永久的陽離子和陰離子或可質子化的陽離子)和不同摩爾比的其他材料生成一個脂質體文庫，包載mRNA編碼熒光素酶進行體內篩選。通過增加永久性陽離子脂質1，2-二烯烴-3-三甲氨基丙烷(DOTAP)的摩爾百分比(0-100%)，可使熒光素酶的表達在靜脈注射後從肝臟轉移到脾臟和肺。LNPs中加入10-40%的永久性陰離子脂質1，2-二烯醇化酶-sn-甘油-3-磷酸(18PA)可在脾臟中特異性表達熒光素酶。加入20%的其他可電離的陽離子脂類，如1，2-二烯酰-3-二甲基氨基甲烷-丙烷(DODAP)，不會改變生物分佈，但增加了mRNA對肝臟的遞送。該方法的普遍性通過將LNP與其他永久性帶電或可電離的陽離子脂類功能化而得到證實，這導致了器官表達的類似變化，且表現出與脂類相關的方式。值得注意的是，SORT-LNP的療效離不開可電離的陽離子脂質包合。給予肺、脾臟和肝臟特異性mRNA
SORT-LNP的篩選結果表明，基於熒光素酶的篩選可產生持續的治療性蛋白，且無明顯毒性。重要的是，SORT方法還允許調節LNPs組織特異性熒光素酶的表達，使其與臨牀批准的Onpattro配方相同。
Cheng等人也報道了使用SORT-LNPs進行組織特異性CRISPR/Cas基因編輯。相對於治療性基因沉默或表達，基於CRISPR/Cas的基因編輯需要(至少)兩個組成部分：引導RNA (guide RNA， gRNA)識別目標DNA和Cas核酸酶進行雙鏈斷裂。作者生成了包含gRNA和Cas9 mRNA或gRNA/Cas9核糖核酸蛋白複合物的SORT-LNPs，並在肝外組織中進行了基因編輯。在紅色熒光蛋白tdTomato報告小鼠中，不同種類的LNP劑型可選擇性誘導肝、肺、脾特異性基因編輯。此外，作者還展示了內源性靶基因(PTEN)和治療性靶基因(PCSK9)的組織特異性編輯。
7.Nat Cancer：Crispr技術揭示淋巴瘤弱點
doi:10.1038/s43018-020-0054-2
在最近一項研究中，美國加州大學聖地亞哥醫學院和摩爾斯癌症中心的研究人員團隊利用CRISPR技術鑑定出了侵襲性慢性骨髓性白血病的關鍵調節劑。
“我們利用CRISPR技術在白血病細胞中進行全基因組篩查，一次性阻斷數千個基因。這是一個非常強大的工具，使我們能夠識別出助長白血病生長的眾多基因，並找到了可以在這種疾病中靶向治療的新漏洞。“高級作者、藥理學和醫學系教授Tannishtha
Reya博士説。“這項研究還首次表明，基於全基因組CRISPR的篩查實際上可以以更符合生理學的方式進行：使用原生癌細胞，並在原生微環境的環境中進行。”
在2020年4月20日的《Nature
Cancer》雜誌上發表的文章中，Reya及其同事確定了RNA結合蛋白是維持和保護耐藥性白血病幹細胞的一類關鍵蛋白。作者們重點研究了Staufen2(Stau2)，這是RNA結合蛋白家族中一個相對較少研究的成員，以前只知道它能控制大腦和神經系統的發育。
該團隊開發了一種小鼠模型，在該模型中，Stau2被基因刪除。作者發現，丟失這種蛋白會導致白血病的癌細胞生長和繁殖能力大大降低，並明顯提高了小鼠模型的整體存活率。Stau2也是白血病患者原代組織樣本的持續生長所需要的，這表明在人類疾病中存在着保守的依賴性。
8.Mol Ther：研究表明基因療法可以成功治療青光眼
doi:10.1016/j.ymthe.2019.12.012
由布里斯托爾大學領導的一項新研究表明，一種常見的眼病--青光眼，可以通過單次注射的基因療法成功治癒，這將改善許多患者的治療方案、療效和生活質量。他們測試了一種新的方法，可以提供額外的治療選擇和好處。他們的研究結果發表在《Molecular Therapy》雜誌上。
研究人員設計了一種基因療法，並利用實驗性青光眼小鼠模型和人類供體組織進行了概念驗證。該療法針對眼睛的一部分稱為睫狀體的結構，睫狀體產生的液體可以維持眼內的壓力。利用最新的基因編輯技術CRISPR，作者能夠使睫狀體中的一種名為Aquaporin 1的基因失活，導致眼壓降低。
文章作者，布里斯托爾醫學院客座高級研究員Colin Chu博士説。“目前，青光眼還沒有治癒的方法，如果不及早診斷和治療，會導致視力下降。我們希望在不久的將來推進這種新療法的臨牀試驗。如果成功的話，可以通過單眼注射的方式長期治療青光眼，這將改善許多患者的生活質量，同時節省時間和金錢。”
9.Science子刊：幹細胞遺傳修飾可改善糖尿病
doi:10.1126/scitranslmed.aax9106
根據最近一項研究，研究人員利用從一名患有罕見的胰島素依賴型糖尿病（Wolfram綜合症）的患者皮膚上提取的細胞誘導產生多能幹細胞，並且將其轉化為分泌胰島素的細胞，通過基因編輯工具CRISPR-Cas9，糾正導致該綜合症的基因缺陷。然後，他們將這些細胞植入小鼠體內，並治癒了這些小鼠的糖尿病。
這一來自華盛頓大學醫學院聖路易斯分校的研究人員的研究結果表明，CRISPR-Cas9技術可能作為治療糖尿病，特別是由單一基因突變引起的糖尿病的有力武器。該研究於4月22日在線發表在《Science Translational Medicine》雜誌上。
“這是CRISPR首次被用於修復因基因缺陷引起的糖尿病，“共同研究者、華盛頓大學醫學和生物醫學工程助理教授Jeffrey R. Millman博士説。