THP-1基因敲除細胞系 ——免疫與炎症研究的利器_風聞

THP-1細胞系是從一名患有急性單核細胞白血病的1歲小男孩的外周血中分離得到的，自1980年建系以來，THP-1細胞被廣泛用於單核細胞和巨噬細胞相關的機制、信號通路以及營養和藥物運輸等研究中。相對於U937、HL-60、ML-2等白血病細胞系，THP-1更有類似人原代單核細胞的形態和功能特徵（包括細胞分化標記）。相對於人外周血單核細胞（PBMC），THP-1更易在實驗室中培養和擴增，且具有更穩定的基因背景，不存在PBMC的個體差異性問題，利於實驗結果的重現。因此，THP-1是各大實驗室常用的急性單核細胞白血病細胞系，是研究免疫和炎症的理想工具。

THP-1 的應用——巨噬細胞分化與炎症模型

THP-1與人原代單核細胞都可以被誘導分化為巨噬細胞M1和M2，並釋放相應的細胞因子。

巨噬細胞M1極化：

**·**THP-1可被佛波酯(PMA)誘導分化為巨噬細胞，並且可再通過脂多糖(LPS)和IFN-γ誘導M1極化，釋放出TNF-α、IL-6等細胞因子，這是典型的炎症模型。

· 巨噬細胞M2極化：

通過 IL-4 、IL-13和巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）誘導可實現M2極化，分泌TGF-β、IL-10等抑制性細胞因子，這與炎症後期的組織修復和重建的過程類似。

· 粥樣硬化慢性炎症模型：

在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）的作用下，巨噬細胞可進一步形成泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化斑塊內出現的特徵性病理細胞，是一種慢性炎症模型。

THP-1 與CRISPR/Cas9技術相結合，有助於免疫和炎症的疾病研究

THP-1是一種近四倍體的懸浮細胞，常規的基因編輯方法在THP-1中陽性率很低。由於CRISPR/Cas9易於構建、效率較高和在人細胞中的毒性較低，在基因編輯應用中備受青睞。

使用CRISPR/Cas9構建THP-1基因敲除模型，發現與巨噬細胞清除病原體的關鍵基因

巨噬細胞的吞噬體酸化是其清除病原體的必需步驟，吞噬體酸化與巨噬細胞的代謝以及營養物質轉運息息相關，而代謝物的轉運與溶質運載蛋白（SLC）密不可分。研究人員發現SLC家族中的碳酸氫鹽轉運體SLC4A7是巨噬細胞的吞噬體酸化必需的基因。通過CRISPR/Cas9技術在THP-1細胞敲除SLC4A7，吞噬體的酸化能力降低，從而其胞內的殺菌能力也相應降低。進行野生型SLC4A7回補後，則增強了吞噬體酸度。這表明巨噬細胞中SLC4A7介導的、碳酸氫鹽驅動的對細胞質pH的維持和對吞噬體酸化至關重要[3]。CRISPR-U™可以通過核轉染法高效地將gRNA和Cas9轉入THP-1細胞中，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出基因敲除的陽性克隆。

使用CRISPR/Cas9與THP-1細胞，構建慢性肉芽腫病(CGD)疾病模型，有助於開發更有效的疾病治療方法

慢性肉芽腫病(CGD)是一種罕見的X連鎖的遺傳病，由於機體的CYBB基因發生突變或缺失，導致巨噬細胞缺乏煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶，無法產生過氧化氫來有效殺滅入侵的微生物，這通常會導致細菌和真菌等微生物引起的嚴重反覆感染。有研究者利用CRISPR/Cas9技術，在THP-1細胞中進行CYBB基因的敲除和點突變c.90C>G（該點突變曾在一例CGD患者中被發現），成功構建了首個CGD的細胞模型。對比野生型的THP-1細胞，研究者構建的2個KO克隆（#3和#27）和1個點突變克隆（#2，c.90C>G）在經過PMA和LPS誘導後均出現了H2O2水平降低，同時IL-1β、TNF-α和IL-6釋放量的明顯上升，這與CGD疾病中巨噬細胞的表現一致。

隨後，研究者通過慢病毒轉染的形式進行CYBB回補，則扭轉了這個局面。​這種新的CGD細胞模型為疾病研究提供了強有力的工具，將有助於開發更高效的治療方法，從而改善患者的生活質量

CRISPR-U™可以通過核轉染法高效地將CRISPR/Cas9以及ssODN共轉入THP-1細胞中，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出點突變的陽性克隆。

通過建立基因敲除和敲入的THP-1細胞模型，明確胞內抗病毒反應的信號通路

DNA通常定位於細胞核中，而異常定位在胞漿中的DNA與通常與病毒感染或腫瘤發生有關。cGAS-cGAMP-STING信號通路可檢測胞漿dsDNA的存在，並誘導強效的免疫反應，產生干擾素和激活其他免疫應答基因。與之對應的，RIG1-MAVS可以檢測胞漿內的pppRNA（一類dsRNA，某些病毒的基因組），並誘導免疫應答。有時候胞漿內會出現RNA和DNA的雜交複合物，這種分子通常在某些病毒感染的情況下出現。為了研究這種RNA-DNA複合物是通過哪個通路激活免疫應答，研究者分別構建了MAVS、cGAS、STING敲除的THP-1細胞，分別將dsDNA、pppRNA、RNA-DNA複合物導入細胞，發現RNA-DNA複合物是通過cGAS-cGAMP-STING通路進行免疫激活。

隨後，研究者通過CRISPR/Cas9技術將2A-GLuc敲入到IFIT1基因座，使其受IFIT1的啓動子驅動表達，IFIT1是一個典型的干擾素激活表達的基因。後續實驗顯示，導入RNA-DNA複合物後，由於干擾素的表達，激活了IFIT1啓動子驅動GLuc的表達。這些結果進一步證明了胞漿的RNA-DNA複合物是通過cGAS-cGAMP-STING信號通路激活免疫反應，為抗病毒研究提供了思路[5]。CRISPR-U™可以通過使用通過核轉染法高效地將gRNA、Cas9和Donor共轉入THP-1細胞中，進行藥篩，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出敲入純合的陽性克隆。

CRISPR-U™可在THP-1細胞中進行高效的基因編輯

CRISPR-U™應用於基因編輯細胞系的獨家技術（基於CRISPR

/Cas9技術），通過優化基因編輯載體和基因編輯流程，CRISPR-U™技術的基因切割效率和重組效率是普通的CRISPR/Cas9技術的10倍以上，可輕鬆實現基因敲除（KO）、點突變（PM）、基因敲入（KI），定製您的基因編輯THP-1細胞系及其他單核細胞系，為您實現各種轉基因的需求，助力您的研究。

參考文獻：

[1] Tsuchiya S, Yamabe M, Yamaguchi Y, et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP‐1)[J]. International journal of cancer, 1980, 26(2): 171-176.

[2] Chanput W, Mes J J, Wichers H J. THP-1 cell line: an in vitro cell model for immune modulation approach[J]. International immunopharmacology, 2014, 23(1): 37-45.

[3] Sedlyarov V, Eichner R, Girardi E, et al. The bicarbonate transporter SLC4A7 plays a key role in macrophage phagosome acidification[J]. Cell host & microbe, 2018, 23(6): 766-774. e5.

[4] Benyoucef A, Marchitto L, Touzot F. CRISPR gene-engineered CYBBko THP-1 cell lines highlight the crucial role of NADPH-induced reactive oxygen species for regulating inflammasome activation[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2020.

[5] Mankan A K, Schmidt T, Chauhan D, et al. Cytosolic RNA: DNA hybrids activate the cGAS–STING axis[J]. The EMBO journal, 2014, 33(24): 2937-2946.