瞭解環狀RNA基因敲除細胞株原理_風聞

隨着越來越多內源性的circRNA被發現在人體組織中有着廣泛表達，circRNA與疾病的關係逐漸成為焦點。目前研究最多的是circRNA與實體瘤之間的關係，促進腫瘤生成的一些circRNA，如頭頸部鱗狀細胞癌中的circPvt1；結直腸癌，食道鱗狀細胞癌和肝細胞癌中的cirs-7（CDr1as）。抑制腫瘤的circRNA，如膠質母細胞瘤中的circsMARCA5 and circ-SHPRH。還有一些circRNA在不同組織或不同細胞所起的作用可能不同，如circHiPK3，在直腸癌中是原癌基因，但是在膀胱癌中又是抑制癌細胞的。

除了癌症，研究還發現circRNA與糖尿病，心血管疾病，慢性炎症和神經系統疾病都有密切的關係。相信隨着生物技術的發展以及越來越多對circRNA的深入研究，circRNA的形成和作用機理可以更加清晰，在疾病預防，檢測及治療方面也可以起到重要的作用。

 circRNA敲除是指在基因DNA水平進行編輯，達到徹底敲除的目的。CRISPR-U™是源井生物自主研發的細胞基因編輯技術，比普通CRISPR/Cas9技術的基因切割效率提高10-20倍。通過CRISPR-U™將gRNA和Cas9轉入細胞中，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出敲除circRNA的陽性克隆。

circRNA敲除方案比較難設計，一般會使用以下兩種方法：

方案一

將兩條gRNA分別設計在circRNA exon的兩端，直接敲除環化的外顯子序列。這種方案雖然敲除徹底，但是在敲除circRNA的同時，也會影響到編碼蛋白的親本基因，需要根據具體的實驗目的考慮是否可行。

方案二

通過破壞circRNA成環來達到敲除的目的。需要先找到circRNA的成環元件，成環元件一般位於被環化外顯子兩端的長側翼內含子中。找到成環元件後，在兩端設計gRNA進行敲除，既不破壞編碼基因的外顯子，又可以實現circRNA的敲除。

源井生物憑藉豐富的基因編輯方案設計經驗，對circRNA設計敲除外顯子側翼內含子中的成環元件的方案，來達到破壞circRNA成環同時又不影響編碼基因表達的目的。結合CRISPR-U™高效編輯技術，效率是普通方法的10倍，可以快速篩選出circRNA敲除的陽性克隆。

應用案例：

 circ-HIPK3是人體細胞內含量豐富的一種環狀RNA，它可以與多種miRNA結合，作為細胞生長的調節劑，影響腫瘤的形成。為了驗證circ-HIPK3成環的機制，需要找到側翼內含子中的成環元件，對上下游預測的兩個成環元件分別設計一對sgRNA，利用CRISPR/Cas9系統將預測的成環元件進行敲除，檢測circRNA表達情況是否發生變化。經過PCR和RT-QPCR驗證，發現下游成環元件敲除後，circHIPK3表達明顯下調，而上游成環元件敲除後，circHIPK3的表達不僅沒有下調還有所升高。推測可能是上游的成環元件序列太多，預測的不準確。為了進一步驗證是其他成環元件驅動的成環，將gRNA3或gRNA4分別與gRNA5或gRNA6共注射，敲除成環元件上游大片段內含子。RT-QPCR結果顯示circHIPK3表達確實下降了，説明上游是由其他的成環元件起到成環的作用。

參考文獻：

Zheng, Q., Bao, C., Guo, W., Li, S., Chen, J., Chen, B., … & Liang, L. (2016). Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3

that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Naturecommunications, 7(1), 1-13.