一文讀懂基因敲入細胞系原理_風聞

基因敲入細胞系

通過核轉染法將gRNA、Cas9和Donor共轉入細胞中，進行藥篩，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出敲入純合的陽性克隆。敲入熒光報告基因的也可以通過觀察熒光進行初步篩選。

敲入方案

特定位點融合蛋白：

gRNA和Cas9複合物造成靶位點DNA雙鏈斷裂後，細胞以外源攜帶敲入片段的Donor作為模板進行同源重組修復（HDR），將敲入片段重組到基因組靶位點。

敲除特定基因同時敲入外來基因片段：

服務流程及質量控制

應用案例

攜帶嵌合抗原受體（CARs）的T細胞可以介導腫瘤排斥反應，是治療B細胞惡性腫瘤的有效方法。通過CRISPR-Cas9技術，在T細胞中，利用Donor載體同源重組將具有CD19特異性的CAR片段替代TRAC基因，不僅可以在人外周血T細胞中獲得均勻的CAR表達，而且還可以增強T細胞的免疫應答能力。

CRISPR/Cas9靶向CAR基因整合入TRAC位點。

1928z是具有CD19特異性的CAR片段

TCR/CAR流式圖

Cas9，gRNA 和donor同時存在時，4天后能檢測到敲入蛋白CAR的表達。

Reference：

Eyquem, J., Mansilla-Soto, J.,Giavridis, T., van der Stegen, S. J., Hamieh, M., Cunanan, K. M., …& Sadelain, M. (2017). Targeting a CAR tothe TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature, 543(7643), 113.

來源 | 源井生物

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