科研利器：基因編輯Huh-7細胞系—助力冠狀病毒、藥物代謝、癌症研究_風聞

肝臟作為人體五臟之一，與機體正常的代謝、解毒、凝血等過程息息相關，並且參與機體免疫，是維持機體生命不可缺少的重要器官。在進行肝臟疾病的研究中，合適的細胞模型是重要的工具之一，但由於常規肝細胞獲取困難、培養難度高、培養成本高昂，在一定程度上制約了肝臟疾病研究的發展。因此，在肝臟研究中選擇培養簡單、遺傳背景穩定的肝細胞系則成為了一種替代選擇，其中Huh-7是最為常用肝癌細胞系之一。

Huh-7肝細胞系的應用

Huh-7細胞系由Nakabayshi、H.和Sato，J建立於1982年，是從一名57歲的日本男性的肝臟腫瘤中提取的高分化肝細胞來源的癌細胞系，呈上皮樣形態。大多數Huh-7細胞的染色體數目在55 - 63之間，具有高度異質性。

肝炎病毒研究

Huh-7對丙肝病毒(HCV)高度敏感，到目前為止，Huh-7及其衍生細胞株是唯一能夠有效複製丙型肝炎病毒（HCV）的細胞系，因此Huh-7常被用作研究HCV的模型。可用於篩選抗丙型肝炎病毒的候選藥物，和開發抗丙型肝炎的新藥。

異種移植模型

可用於建立細胞系來源的異種移植（Cell Line Derived Xenograft, CDX）小鼠模型，即Huh-7 CDX模型。此模型可用於臨牀前腫瘤生長抑制的研究，包括激酶抑制劑(例如.BZG-4000）、FGFR4、抗EGFRvIII抗體等新型抗腫瘤生長療法(例如sorafenib和silibinin）。

藥物研究

可用於研究肝癌藥物藥效、代謝，並探討藥物的分子機制。

肝細胞系與*CRISPR/Cas9*技術相結合，為癌症、藥物代謝和冠狀病毒等研究提供新思路！利用CRISPR/Cas9敲除Huh-7的病毒複製關鍵宿主因子，探索冠狀病毒複製的關鍵基因

CypA（環孢素A結合蛋白）是許多RNA病毒複製的重要宿主因子。此外，有些報道稱，一些病毒的複製在不同程度上依賴於CypA。這些研究由於使用了不同的病毒、細胞系和實驗設計，因此很難進行比較。科學家研究了三種可以在Huh-7細胞中複製的單鏈正義RNA病毒的CypA依賴性，分別是馬動脈炎病毒（EAV）、人類冠狀病毒（HCoV-229E）和中東呼吸綜合徵冠狀病毒（MERS-CoV）。通過比較這些病毒在同一親本Huh-7細胞，和用CRISPR/Cas9技術產生的CypA基因敲除Huh-7細胞中的複製。

通過核轉染法將分別打靶 CypA, CypB, CypC和CypD的sgRNA轉入Huh-7細胞中，篩選後獲得陽性cell pool。Huh-7 Cyp KO細胞池感染MERS-CoV（B）、HCoV-229E（C）或EAV（D），MOI為0.01。用菌斑法測定48h p.i.（B，C）或32h p.i.（D）時的病毒產量。在所有四個CypKO細胞池中，MERS-CoV和HCoV-229E的滴度沒有改變（B和C）。在感染Huh-7 CypA KO細胞池後，EAV病毒滴度降低了2-logs，但在其他敲除細胞池中沒有改變。這證明了CypA對EAV的複製起到重要作用。

由於Huh7 CypA-KO細胞池可能存在低水平的CypA表達殘留，這可能仍然足以支持正常水平的MERS-CoV和HCoV-229E複製，因此需要獲得Huh7CypA-KO單克隆。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出CypA敲除的陽性克隆。野生型Huh-7細胞和Huh-7

CypA-KO克隆#1和#2均感染MERS-CoV、HCoV-229E或EAV。在這兩個CypA-KO細胞克隆中，CypA表達的失活顯著降低了MERS-CoV的複製（約3倍）。有趣的是，在這兩個克隆中，沒有發現HCoV-229E缺乏CypA的影響（D）。然而，對於EAV，觀察到病毒產量的~3-log下降（E），與之前使用的Huh-7 CypA-KO細胞池相比，表現出10倍強的抑制作用。

綜上，在CypB-KO、CypC-KO或CypD-KO細胞池中MERS-CoV、HCoV-229E和EAV的複製沒有改變，這表明在Huh-7細胞中，這些病毒的複製不依賴CypB、CypC或CypD。然而，與CypA的情況一樣，我們不能排除（非常）低水平的cyp仍然足以支持有效的病毒複製的可能性。敲除CypA使EAV產量降低約3-log，而MERS-CoV子代滴度降低約3倍，HCoV-229E複製沒有改變。這項研究表明，不同單鏈正義RNA病毒的複製對細胞CypA的依賴性有顯著差異。

CRISPR/Cas9介導的基因敲除和點突變Huh-7藥物代謝模型，便於研究不同基因差異對藥物代謝的影響

體外研究藥物代謝和相關基因變異常常會使用新鮮分離培養或冷凍保存的人和動物肝細胞；然而，原代肝細胞不是最佳選擇，因為它們需要收集肝，價格昂貴；而且它們不是永生化的，在不同的樣本之間存在較大差異。在大多數情況下，細胞系在基因組上是相同的。因此， **研究者開發了一種CRISPR/Cas9基因修飾的人肝細胞系，可持續性地研究基因變異對藥物代謝影響。**研究CYP3A5的變異分別對鎮靜藥或麻醉藥咪達唑侖（MDZ）和免疫抑制劑他克莫司（Tac）這兩種酶底物代謝的影響。

大約50%的口服藥物由CYP3A4和CYP3A5代謝。在P450酶中，CYP3A4和CYP3A5在肝臟中最為豐富，其表達具有高度的變異性。CYP3A5*3（rs776746）等位基因功能缺失在白種人中非常普遍。與具有CYP3A5*1基因型的個體相比，Tac的代謝率較低；然而，CYP3A5*1等位基因在非裔美國人中富集，MDZ、Tac和其他藥物的快速代謝。因此，CYP3A5基因型是決定藥物適宜劑量的重要因素。

到目前為止，還沒有商業化的肝細胞系在7號染色體上二倍體並表達CYP3A5*1。Huh-7細胞系能通過CYP3A4活性將底物MDZ轉化為其代謝產物羥基化的1-OH-MDZ和4-OH-MDZ；然而，Huh-7細胞在MDZ代謝方面不是很有效，因為它們是CYP3A5*3等位基因的純合體。因此，有必要開發一種肝細胞系，可以在細胞培養中模擬與CYP3A5*1基因型相關的藥物快速代謝過程。

通過核轉染法將gRNA和Cas9以及ssODN共轉入Huh-7細胞中，篩選後挑取單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序驗證，篩選出基因敲除的陽性克隆。通過敲除或點突變CYP3A5*3的外顯子3B的剪接連接點，從而獲得了三個CYP3A5*1細胞系。

與野生型Huh-7相比，CYP3A5*1/*3sd（雜合子KO）、CYP3A5*1/*1dd（純合子KO）或CYP3A5*1/*3pm（點突變）表達CYP3A5*1的mRNA，CYP3A5的mRNA和蛋白表達均升高。因此，通過CRISPR/Cas9技術，成功將*3基因型轉化為*1基因型，由此激活Huh-7細胞系中CYP3A5的表達。這個細胞模型可以加快臨牀前的藥物開發，節省時間和金錢，更準確地預測不同人羣或基因型的藥物代謝、藥代動力學、毒性和療效。

CRISPR/Cas9技術將GFP敲入Huh-7細胞的Nanog，揭示肝細胞癌發病率存在性別差異的原因

肝細胞癌（hepatocellular

carcinoma，HCC）是一種常見的惡性腫瘤，其發病率具有明顯的性別差異——明顯傾向於男性。有研究證明，雄激素/雄激素受體信號軸和前列腺癌、宮頸癌等多種激素相關性腫瘤的發病具有相關性。而肝臟作為雄激素代謝的重要場所，其微環境中雄激素水平也較高，肝細胞癌似乎與雄激素/雄激素受體信號軸有着密切關係。

腫瘤幹細胞（Cancer Stem Cells，CSCs）與腫瘤的發生、轉移具有密切關係，其具有自我更新和無限增殖的能力，是癌症發展的關鍵因素。有研究揭示，多能性因子Nanog參與維持CSCs的乾性。但雄激素/雄激素受體信號軸是否通過Nanog相關途徑對HCC細胞的乾性維護產生影響，目前尚不清楚。

研究者發現在肝癌組織中，雄激素受體表達非常高，並與Nanog相關。隨後，通過CRISPR/Cas9將GFP標記huh7細胞內源性Nanog，證實了雄激素受體和Nanog在HCC細胞中的共定位。通過核轉染法將gRNA、Cas9和Donor共轉入huh-7細胞中，進行藥篩，藥篩完成後挑選單克隆培養。選擇不同的克隆分別進行靶位點擴增及測序，篩選出敲入純合的陽性克隆。

這些研究結果顯示， 雄激素/雄激素受體信號軸通過影響腫瘤細胞的乾性，為HCC療法中的這個軸抑制提供了證據，為肝癌治療中軸突的抑制提供了一種可能的途徑。.

通過後續的體外實驗，研究者證明了該信號軸可以促進HCC細胞的乾性，這種作用是以Nanog依賴性的方式並通過激活其轉錄來實現的，而這種作用可以通過雄激素阻斷或AR降解增強子或而被抑制。

CRISPR-U™可在肝細胞系中進行高效的基因編輯

CRISPR-U™是源井生物自主研發的應用於基因編輯細胞系的獨家技術，通過優化基因編輯載體和基因編輯流程，CRISPR-U™技術的基因切割效率和重組效率是普通的CRISPR/Cas9技術的10倍以上，可輕鬆定製KO、KI、點突變肝細胞系，亦可實現各種穩轉株需求。

Reference：

de Wilde A H, Zevenhoven-Dobbe J C, Beugeling C, et al. Coronaviruses and arteriviruses display striking differences in their cyclophilin A-dependence during replication in cell culture[J]. Virology, 2018, 517: 148-156.

Dorr C R, Remmel R P, Muthusamy A, et al. CRISPR/Cas9 genetic modification of CYP3A5* 3 in HuH-7 human hepatocyte cell line leads to cell lines with increased midazolam and tacrolimus metabolism[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2017, 45(8): 957-965.

Jiang L, Shan J, Shen J, et al. Androgen/androgen receptor axis maintains and promotes cancer cell stemness through direct activation of  Nanog transcription in hepatocellular carcinoma[J]. Oncotarget, 2016, 7(24): 36814.

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