這是基因敲除KYSE-150細胞系的成功秘籍-源井生物_風聞
源井生物-让基因编辑更简单！2020-07-03 10:24
KYSE-150細胞系是具有粘附單層的上皮細胞。據報道，細胞攜帶的致癌基因c-erb-B（8倍）和細胞週期蛋白D1（4倍），並且細胞可以在裸鼠中形成腫瘤，因此KYSE-150細胞系經常用於涉及基因編輯的癌症研究中，例如CRISPR基因敲除/敲入和點突變。
應用範圍：
1**. 在KYSE-150細胞中敲除EZH2改變了PSMA3-AS1誘導的食管癌細胞增殖和遷移**
在食管癌患者中，PSMA3-AS1表達上調並且與腫瘤大小和轉移呈正相關。為了進一步探索PSMA3-AS1在食管癌細胞中的生物學作用，研究人員通過慢病毒感染在KYSE150和KYSE450細胞株（PSMA3-AS1表達較低）中建立了穩定的CRISPR PSMA3-AS1過表達細胞株，並驗證了其上調RT-qPCR檢測PSMA3-AS1。
EZH2的CRISPR / Cas9基因編輯已在KYSE150和KYSE450細胞中成功進行，並通過EZH2蛋白表達的顯着降低得到證實。 CCK-8和集落形成分析表明，敲除CRISPR EZH2後，PSMA3-AS1的過表達並不影響食道癌細胞的增殖（圖6B和6C）。根據傷口癒合和transwell遷移分析，與陰性對照細胞相比，ESCC EZH2敲除KYSE-150細胞的傷口癒合和細胞遷移沒有增加。
臨牀病理特徵表明，PSMA3-AS1表達增加與遠處轉移，較大的腫瘤大小和ESCC患者的預後不良呈正相關。
2. CRISPR過表達的KYSE-150細胞增加ESCC中的化學抗性
基於全基因組簇的規則間隔的短迴文重複序列/基於CRISPR的慢病毒文庫（CRISPR / Cas）是用於基因組規模功能獲得或功能喪失篩選的強大工具。該系統已被證明在體外鑑定耐藥基因方面非常有效。 Shalem，Kurata和Joung使用CRISPR基因敲除文庫篩選出了黑色素瘤和AML耐藥性的基本基因。一些研究人員試圖將CRISPR文庫篩選策略與RNA測序技術結合在KYSE-150細胞中，以探索ESCC的關鍵基因和抗化學性的潛在機制。
為了增加鑑定參與PTX抗性的必要基因的機會，進行了綜合分析，以將基因組規模CRISPR篩選中的EN基因與KYSE-150細胞系中的差異表達基因（DE基因）結合起來。
研究人員評估了CDKN1A，ELAVL2和TSPAN4增強ESCC細胞KYSE-150的化學耐藥性的潛力。結果表明，CDKN1A，ELAVL2或TSPAN4的過表達可以顯着增加KYSE-180和KYSE-150細胞對PTX的抗性。此外，過表達的CDKN1A，ELAVL2或TSPAN4也可能有助於KYSE-150細胞的DDP抗性。
3. CRISPR / Cas9介導的KYSE-510細胞中DEPTOR的敲除顯着促進細胞增殖，遷移和侵襲
研究人員發現，DEPTOR的表達負調節ESCC細胞系的致瘤活性。此外，異位DEPTOR表達引起KYSE150細胞的細胞增殖，遷移和侵襲的顯着抑制，而KYSE150細胞的DEPTOR表達水平最低。同時，CRISPR / Cas9介導的KYSE-510細胞中DEPTOR的敲除顯着促進了細胞的增殖，遷移和侵襲。此外，體內試驗進一步顯示，與未經處理的KYSE150細胞相比，異位DEPTOR表達的異種移植物中的腫瘤生長被顯着抑制，而在DEPTOR基因敲除的KYSE-510細胞中腫瘤生長明顯增強。
在這項研究中，科學家們產生了穩定的細胞系，這些細胞系要麼過度表達DEPTOR，要麼通過遺傳消除內源性DEPTOR表達。由於KYSE-150在三種細胞系中表達最低的內源性DEPTOR，因此它們在KYSE-150細胞（pcDNA3.1-DEPTOR）中穩定地過表達DEPTOR。出於相同的考慮，用CRISPR/Cas9系統處理表達最高水平DEPTOR的KYSE-510細胞，以敲除DEPTOR（CRISPR-DEPTOR）。細胞系生成後，與KYSE-150親代細胞和空載體轉染的細胞相比，pcDNA3.1-DEPTOR表現出降低的細胞增殖速率，而CRISPR-DEPTOR細胞的增殖明顯快於對照KYSE-510細胞。此外，pcDNA3.1-DEPTOR細胞也顯示出減少的遷移。
基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生產生產生EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。
源井生物根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計。
方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。
方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。
方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。
1. Yan-Mei Ji, Xue-Feng Zhou, Jun Zhang, Xiang Zheng, Sheng-Bao Li, Zhi-Qiang Wei, Tao Liu, Dong-Liang Cheng, Ping Liu, Kuncheng Song, Tao Tan, Hua Zhu, Jia-Long Guo. DEPTOR suppresses the progression of esophageal squamous cell carcinoma and predicts poor prognosis. 2016 Mar 22; 7(12): 14188–14198. Published online 2016 Feb 16.
2. Qiu BQ, Lin XH, Ye XD, et al. Long non-coding RNA PSMA3-AS1 promotes malignant phenotypes of esophageal cancer by modulating the miR-101/EZH2 axis as a ceRNA. Aging (Albany NY). 2020;12(2):1843‐1856.
3. Zhao, Wen-Si et al. “Genome-scale CRISPR activation screening identifies a role of ELAVL2-CDKN1A axis in paclitaxel resistance in esophageal squamous cell carcinoma.” American journal of cancer research vol. 9,6 1183-1200. 1 Jun. 2019
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