一次讀懂基因敲除Vero細胞系-源井生物_風聞
源井生物-让基因编辑更简单！2020-07-17 09:50
Vero細胞起源於1960年代3月27日的正常成年非洲綠猴的腎臟，是微生物學以及分子和細胞生物學研究（包括涉及對基因的編輯等研究）中最常用的哺乳動物基因細胞系之一。作為需要CRISPR / Cas9技術的基因敲除/敲入。在第93代時，該細胞系被帶到美國國立衞生研究院的國立過敏和傳染病的研究所，並於1966年提供給美國典型培養物保藏中心（ATCC）。
Vero細胞系也是錨固依賴性細胞系，已廣泛用於病毒學研究，但也已用於許多其他方面的細節觀察，包括細胞內細菌和寄生蟲的繁殖和研究，以及化學物質，毒素作用的評估，以及哺乳動物細胞上分子水平的其他物質。因此，基因編輯的Vero細胞，在這些領域的研究中越來越受歡迎。此外，Vero細胞已在美國獲得生產活疫苗（輪狀病毒，天花）和滅活（脊髓灰質炎病毒）疫苗的許可，並且在世界範圍內，Vero細胞已用於生產其他幾種病毒，包括狂犬病病毒，呼腸孤病毒和日本腦炎病毒。這些研究主要與Vero CRISPR / cas9哺乳動物細胞，Vero敲除細胞系，慢病毒包裝和Vero點突變細胞繫有關。 Vero細胞也可以用作真核耳寄生蟲（如錐蟲）的宿主細胞。
圖1. Vero 76細胞（ATCC＃CRL-1587），約95％單層。這些細胞將需要在一天之內進行繼代培養。
Vero細胞在傳代培養過程中生長良好，並發現清晰的細胞膜邊界和良好的細胞質透明度。
Vero細胞的形態相對完整，細胞增殖速度也相對較快。將Vero細胞轉移到燒瓶中後，在培養24小時後可以粘附。培養三天後，細胞可以達到相對靜止的階段。細胞可以在培養的第五天長成單層細胞，並且可以培養到第十二天。發現生長茂密，細胞開始老化直到第十四天。旋轉後的細胞生長速度比旋轉前慢，但是單層細胞的持續時間比旋轉前更長。在支原體檢查期間未發現支原體生長和污染。細胞類型分析結果表明，Vero細胞的核型無明顯異常，染色體數無明顯變化。
Vero細胞系的應用：
Vero細胞可用於多種研究目的。 Vero細胞廣泛用於病毒感染的分子機制研究，疫苗生產和重組蛋白。發現Vero細胞在建立後不久就對許多類型的病毒高度敏感，包括猿猴液泡病毒，麻疹病毒，風疹病毒，節肢動物傳播的病毒和腺病毒。後來發現它對細菌毒素敏感，包括白喉毒素，不耐熱腸毒素和志賀樣毒素。因此，Vero細胞適合作為基因定製模型，例如涉及病毒感染的CRISPR敲除細胞。
1，利用基因敲除的Vero細胞系提高病毒疫苗的生產
疫苗生產成本高昂，阻礙了全球抗擊疾病的疫苗的採用。本文描述的工作遵循了之前的兩個出版物，它們報告了通過對大規模疫苗生產中使用的Vero細胞系進行基因修飾來增強脊髓灰質炎病毒和輪狀病毒疫苗生產的策略。 CRISPR / Cas9基因編輯工具被用於敲除先前顯示在脊髓灰質炎和輪狀病毒生產中起作用的Vero目標基因。隨後，開發了當前行業製造系統的小規模模型，並採用該模型來評估多種穩定的敲除細胞系對脊髓灰質炎和輪狀病毒產量的增加。與以前的研究不同，Vero敲除細胞系未能實現所需的目標產量增加。這些發現表明，在脊髓灰質炎和輪狀病毒疫苗的生產過程中實施基因工程改造的Vero細胞系之前，需要進行更多的研究，以便能夠以較低的價格提供疫苗。
輪狀病毒（RV）是全球範圍內嚴重腸胃炎的主要原因，可導致5歲以下兒童大量與腸胃炎相關的疾病。口服減毒活減毒RV疫苗可以預防疾病，但是高製造成本和冷鏈維持通過siR鑑定了病毒細胞宿主基因的一個子集。
基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。
根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計。
方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。
方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。
方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。
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