基因敲除A549細胞系你不能錯過的文章_風聞
源井生物-让基因编辑更简单！2020-07-17 09:51
簡介：
A549細胞系是於1972年建立的人類非小細胞肺癌細胞系。科學家通過一位58歲的白種人男性的腺癌肺組織的外植體腫瘤轉移並培養了該細胞系。在肺組織中發現的A549細胞是鱗狀細胞，負責水和電解質在整個肺泡中的擴散，還可以通過胞磷膽鹼途徑合成含有高度不飽和的脂肪酸和卵磷脂。相比之下與小細胞肺癌（SCLC），該細胞系的侵襲性較小且擴散速度較慢，但事實證明它更為普遍，佔所有肺癌病例的85-88％。 A549細胞已成為II型肺泡上皮細胞的基因敲除細胞模型，這意味着A549 KO細胞系可用於研究肺組織的代謝過程以及藥物向組織的可能傳遞機制。該細胞系目前被用作體外和體內模型，通過一些基因編輯技術（例如CRISPR / Cas 9）研究肺癌和正在開發的藥物療法，這使A549成為適合基因敲除的細胞系。基因敲除的定製過程。
A549細胞的快速繁殖可以歸因於環氧合酶2的顯着表達。在體外培養A549細胞時，它們通常會生長成附着或緊密依附着培養基的單層細胞。當生長時間足夠長時，A549細胞即將經歷細胞的分化。
A549細胞可用於病毒研究和相關蛋白質表達的變化。另外，由於這些細胞是合適的轉染宿主，因此它們已被用作紫杉醇和貝伐單抗的試驗場所以開發新的肺癌藥物。
應用**：**
使用CRISPR指導的基因編輯方法創建NRF2基因敲除克隆A549細胞系
越來越明顯的是，CRISPR指導的基因編輯將對癌症和遺傳性疾病的新治療方法的發展產生重大影響。隨着對癌症治療組合方法關注發展，建立起了基因編輯技術，可以敲除靶基因這一事實至關重要。研究人員利用CRISPR/Cas9通過破壞NRF2核輸出信號（NES）域的功能性來禁用肺癌細胞A549中的NRF2基因。該蛋白質在培養後被大量阻止到轉移細胞核中。並且在細胞的組織培養中慢慢地產生了穩轉細胞株的構建，發現有基因敲除的A549細胞具有降低的表型，並且對化學治療劑（例如順鉑和卡鉑）更敏感。這些觀察結果在異種移植小鼠模型中得到了證實，即使在沒有藥物治療的情況下，純合的原代的敲除細胞的增殖速度也比野生型細胞慢。腫瘤生長被阻止到16天，在接受CRISPR指導的基因編輯和化療聯合作用的樣品中觀察到腫瘤體積顯着減少。
在這種情況下，研究人員將NRF2基因作為目標，因為它是細胞排毒以及對氧化和親電子應激反應的中央調節器。當細胞進入壓力環境（例如遇到有毒物質）時，NRF2的表達增加。因此，通過破壞NRF2，該結果表明了化學治療劑，例如順鉑和卡鉑，將更有效地工作並且劑量更低。從廣義上講，這種方法最終將導致產生相同的殺腫瘤活性所需的化學療法水平降低，從而改善癌症患者的生活質量。公認的非小細胞肺癌細胞系A549在KEAP1的Kelch結構域中具有了一個突變，導致NRF2的過度表達，它經常被用作發現針對癌症的新型治療藥物的金標準。
基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促進紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。
源井生物根據客户需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計。
方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。
方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。
方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。
