基因敲除誘導型細胞系_風聞

1.開發用於大規模功能篩選的藥物誘導性CRISPR-Cas9系統

應用基因敲除CRISPR/Cas9技術的大規模基因篩選，現已成為了發現和驗證基因功能的有力方法。在CRISPR細胞敲除篩選的過程中，控制基因擾動時間的能力將有助於精確解剖動態和複雜的生物過程。據報道，藥物誘導的CRISPR-Cas9系統的優化，允許在時間的控制下進行高通量基因詢問。

研究人員設計了多種藥物誘導的sgRNA表達載體，並使用EGFP基因破壞測定法在11種人的原代細胞和小鼠細胞系中測量了它們的活性。最佳設計可在體外和體內對基因敲除進行嚴格且可誘導的控制。接下來，使用誘導型和組成型CRISPR-Cas9系統進行全基因組並行功能喪失篩選。在基於增殖的輟學篩選中，這兩種方法在區分必需的基因和非必需的基因方面具有相似的性能。在需要細胞因子刺激和細胞染色的更具挑戰性的表現分析中，科學家觀察到本構和藥物誘導篩選方法在檢測已知命中中具有相似的敏感性。重要的是，在大規模設置中，在沒有化學誘導劑的情況下，我們的可誘導CRISPR篩選平台的最小泄漏。

2.用誘導型CRISPR/Cas9在人細胞中進行有條件的基因敲除

易於編程和高效的CRISPR/Cas9核酸酶系統的出現徹底改變了基因工程。儘管使用CRISPR/Cas9進行常規基因敲除實驗非常有價值，但它們並不十分適合研究動態情況（例如發育或疾病）中特定階段的基因功能。在這裏，我們描述了一種基於CRISPR/Cas9優化誘導型的基因敲除方法，用於人類細胞中的條件性功能喪失研究。此方法依賴於改進的四環素誘導系統，用於條件表達驅動Cas9活性的單向導RNA（sgRNA）。為了確保均勻且穩定地表達，在對AAVS1基因組安全篩選中，能高效的進一步遺傳工程後，表達了必要的轉基因。當在人類多能幹細胞（hPSC）中實施時，該方法實際上可以有效地應用於處於發育或疾病各個階段的任何hPSC衍生的人類細胞類型。

3.使用CRISPR/Cas9基因工程技術誘導人類基因敲除人類幹細胞

人類多能幹細胞（hPSC），包括胚胎幹細胞（ESC）和誘導性多能幹細胞（iPSC），是闡明人類遺傳背景下早期發育和疾病發病機制中調控過程的有用工具。基因修飾，包括基因敲除（KO），進一步擴展了hPSC在研究人類胚胎發生或人類遺傳疾病中的基因功能方面的實用性。因此，對hPSC中的基因敲除KO進行精確的時間控制通常對於闡明構成複雜人類特徵基礎的基因功能和分子途徑通常是必要的或非常有益的。基因表達或缺失的精確時間控制對於闡明生物系統中的基因功能至關重要。然而，具有誘導基因敲除（iKO）的人類多能幹細胞（hPSC）系的建立仍然具有挑戰性。因此，科學家探索了通過將CRISPR/Cas9介導的基因組編輯與Flp/FRT和Cre/LoxP系統相結合來構建iKO hPSC系的方法，並進一步開發了一種策略，可以同時插入一個活性可控制的重組酶表達盒，並去除耐藥基因加快了iKO hPSC品系的產生。此兩步策略用於建立人類胚胎幹細胞（hESC）和具有iKO的多能幹細胞（iPSC）系，即SOX2，PAX6，OTX2和AGO2的iKO，這些基因表現出不同的結構佈局和時間的表達模式。 iKO hPSC系的可用性將大大改變我們檢查人類細胞基因功能的方式。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成人糖基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

Reference:

5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science. Cell Science from Technology Networks. Retrieved 2020-03-25.

Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.

Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362

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