基因敲除構巢麴黴的研究-源井生物_風聞

構巢麴黴（Aspergillus nidulans），也被稱為構巢麴黴（Emericella nidulans），是遺傳學和細胞生物學中重要的真菌系統之一。它一直是研究真核細胞生物學的重要研究對象，也是當下科研界最看重的一方面，這些包括重組，DNA修復，突變，細胞週期控制，微管蛋白，染色質，慢病毒包裝，核動力學，致病性，代謝和實驗進化。 

真菌在降解生態系統中的生物量方面起着重要作用，因為它們會降解所有類型的有機物。因此，它們是與工業有關的酶有主要來源，例如澱粉酶，纖維素酶，脂肪酶，果膠酶和蛋白酶。完全測序的真菌基因組的數量正在迅速增加。由於大多數絲狀真菌的遺傳工具開發欠佳，因此目前很難使用基因工程來了解這些真菌的生物學特性並在工業中充分利用它們。因此，為了開發一種可用於遺傳操縱非模型絲狀真菌的通用方法，科學家們開發了一種適用於絲狀真菌的基於CRISPR-Cas9的系統。CRISPR技術通過提高可進行實驗的速度和複雜性，徹底改變了真菌基因工程。另外，該系統的效率通常允許將基因工程引入非模型物種。紫花苜蓿（Emericella

nidulans）作為工業化學品和酶的來源已有很長的生產歷史，並且是用於研究遺傳調控，發育生物學，信號轉導和次級代謝的發育模型系統。因此，基因敲除，基因敲入或點突變將成為研究構巢麴黴的新方法。

CRISPR****在構巢麴黴中高效無標記基因靶向中的應用

特定Cas9/sgRNA介導的DNA雙鏈斷裂（DSB）的存活取決於向NHEJ

DNA修復途徑中添加非同源末端。我們利用這一觀察結果開發了TAPE工具，以評估構巢麴黴原型間隔物的效率。而且，在NHEJ缺陷型菌株中，可以進行有效的無標記基因靶向。確實，該研究表明，甚至單鏈寡核苷酸也可以有效地用作構巢麴黴和黑麴黴中特定Cas9/sgRNA誘導的DNA DSB的修復模板，表明這種修復類型可能廣泛分佈於絲狀真菌傳播中。 重要的是，通過使用單鏈寡核苷酸進行CRISPR-Cas9介導的基因編輯，可以以接近100％的效率引入特異性點突變和基因缺失（基因敲除）。因此，可以在一個轉化實驗中非常有效地引入兩點突變和單基因插入。

Cpf1可以在Aspergilli****中快速有效地執行基因組編輯

CRISPR基因編輯的效率歸因於RNA引導的核酸酶形成的特定DNA雙鏈斷裂。到目前為止，在絲狀真菌中，只有Cas9被用作CRISPR核酸酶。由於用Cas9編輯的基因受到其5’-NGG-3’原間隔子相鄰基序（PAM）序列的限制，因此重要的是，引入依賴於其他PAM序列的RNA指導的核酸酶以靶向更大的基因組位點。基因敲除大腸桿菌的Cpf1使用由5’-TTTN-3’組成的PAM序列，因此實現此目標是一個有吸引力的選擇。在這項研究中，針對構巢麴黴優化的Lb_cpf1密碼子可用於絲狀真菌中基於CRISPR的基因編輯。研究人員開發了一種基於載體的設置用於Cpf1介導的CRISPR實驗，並表明它可以在構巢麴黴和黑麴黴的不同基因座上高效工作。具體而言，Cpf1可以催化寡核苷酸介導的基因組定向誘變和無標記基因靶向。結果表明，Cpf1可以有效地用於麴黴中的基因編輯，從而擴大了CRISPR技術可靶向的基因組DNA序列的範圍。

Nidulans中的高效CRISPR****敲除

在構巢麴黴中，可以通過轉化過程中的同源重組進行基因靶向，但是正確的基因靶向頻率是可變的，通常較低。研究人員確定了人KU70基因的構巢麴黴（nkuA），這對於雙鏈斷裂修復中DNA的非同源末端連接至關重要。

nkuA（nkuAΔ）的缺失大大降低了轉化DNA片段的非同源整合的頻率，從而顯着提高了基因靶向性。在構巢麴黴中也已經開發了替代的異源標記，但是在構巢麴黴基因組中的任何時候都沒有指導整合。 nkuAΔ和異源選擇標記一起形成非常有效的靶向sy的基因。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

References:

1. GAN Shi-Hu, CUI Xiao-Teng, MA Jin-Zheng, FANG Li-Jiao, LIU Ming-Xia, REN Yuan-Yuan, CAO Xiao-Na, YANG Jie, SU Chao.

2.Using CRISPR-Cas9 gene-editing technology to knock out the Tudor-SN gene of H9c2 cells to inhibit cell cycle arrest and proliferation. Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 2018.07.10. 2. Deng Qin, Liu Cheng, Zhang Jing, Li Gang. The effect of knocking out C3G on the proliferation and apoptosis of H9C2 cardiomyocytes. Chinese Journal of Cell Biology: 1-6[2020-06-09].

3. HU Su-lei, LI Gang, FU Yan-bo, DENG Qin, LIU Cheng. Dock180 knockout inhibits proliferation and promotes apoptosis of rat derived H9C2 cardiomyocytes strain. Basic & Clinical Medicine. 2017, 37(4).

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