基因敲除里氏木黴可改變生物體基因組的遺傳-源井生物_風聞

木質纖維素生物質主要由纖維素，半纖維素和木質素組成，是地球上最豐富，可再生的能源。木質纖維素生物質的降解和自然界中碳循環的持續主要通過微生物作用來維持，包括不同的真菌物種，如木黴，麴黴和青黴菌。微生物在自然界中起着重要作用。這些生物產生的降解生物質的酶也可用於食品，飼料，造紙和紡織工業等各個領域。里氏木黴（Trichoderma

reesei）是一種真菌，是纖維素酶和半纖維素酶的知名高效生產商，因此被酶工業廣泛用於生產其自身的內源酶以及生產異質蛋白。兩年來，許多研究表明，CRISPR/Cas9系統是一種強大的基因組編輯方法，基因敲除可促進多種生物體中基因組的遺傳改變。到目前為止，還沒有關於CRISPR/Cas9系統或其他系統的報道。

儘管該技術已成功應用於酵母中，但絲狀真菌，甚至是模型生物Neurospora crassa中的基因組編輯方法也是如此。

里氏木黴（Teelemorph Hypocrea jecorina）是一種嗜温軟腐子囊真菌，在工業上被廣泛用作纖維素酶和半纖維素酶的來源，用於水解植物細胞壁多糖。來自農作物殘餘物，草，木材和城市固體廢物的木質纖維素生物質代表了豐富的可再生資源，作為未來的生物燃料來源，這一資源變得越來越重要。微生物是地球上對環境無害的肝臟。儘管用纖維素乙醇代替汽油可以顯着減少大氣中的温室氣體並減少全球變暖，但將生物質多糖水解為可發酵糖的高成本仍然是必須有效克服的主要障礙，才能使纖維素乙醇有效地商業化。由於纖維素酶和半纖維素酶的成本大大影響了生物乙醇的價格，因此需要這些酶的廉價得多的來源。因此，基因工程技術，基因敲除方案和DNA介導的轉化系統改善了產工業酶的里氏木黴菌株。

使用CRISPR/Cas9系統在里氏木黴中進行有效的基因組編輯

 研究人員通過特異性密碼子優化和體外RNA轉錄證明了在絲狀真菌里氏木黴中建立CRISPR/Cas9系統。結果表明，通過誘導Cas9表達，CRISPR/Cas9系統是可控的和有條件的。該系統通過有效的同源重組，甚至使用短的同源臂，在靶基因中產生了位點特異性突變。該系統還提供了同時靶向多個基因的適用且有希望的方法。我們的結果表明，CRISPR/Cas9系統是里氏木黴和其他絲狀真菌物種最有力的基因組操縱工具，這可能會加速這些絲狀真菌的功能基因組學和菌株改良研究。

使用體外組裝的Cas9/gRNA複合體在里氏木黴中快速破壞基因

在這項研究中，研究人員使用CRISPR / Cas9在里氏木黴菌中測試了兩種基因破壞方法。細胞內表達的Cas9導致里氏木黴QM9414出現意外脱靶基因破壞，有利於在目標ura5下游70和100 bp處插入9或12 bp。因此，通過在體外組裝Cas9和gRNA，然後將核糖核蛋白複合物與含有pyr4標記基因的質粒轉化為里氏木黴TU-6，建立了另一種方法。當使用靶向cbh1的gRNA時，發現27個轉化子中有8個失去表達CBH1的能力，這表明通過基因組編輯成功破壞了cbh1。將包含共轉化質粒，染色體基因或這些核苷酸混合物的大DNA片段插入到破壞的cbh1基因座中.Cas9 / gRNA複合物直接轉化入細胞是破壞里氏木黴基因的快速方法並可能在菌株改良和功能基因組學研究中得到廣泛應用。

銅控制的RNA干擾系統，用於里氏木黴中靶基因的可逆沉默

研究人員將銅響應性tcu1啓動子整合到RNAi介導的沉默系統中，以開發一種可控制的RNAi介導的沉默系統，即一種里氏木黴。作為概念的證明，當各自的RNAi片段被敲除時，在無銅的情況下，成功地敲除了原養型pyr4基因，由Avicel誘導的高表達cel7a和xyr1基因以及敲除被證明難以治療的fab1基因表達。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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