基因編輯康克酵母知識科普-源井生物_風聞

酵母是被歸類為真菌界成員的真核單細胞微生物。第一種酵母起源於數億年前，目前已鑑定出1,500種。據估計它們佔所有描述的真菌種類的1％。大多數酵母通過有絲分裂無性繁殖，也有許多通過不對稱分裂過程（即出芽）進行繁殖。通過發酵，酵母物種釀酒酵母將碳水化合物轉化為二氧化碳和酒精。啤酒，葡萄酒和麪包的歷史與酵母發酵有關。它也是近代的細胞學，原代細胞研究的過程中最重要的模型生物，並且是研究最深入的真核微生物之一。研究人員已經使用它來收集有關真核細胞生物學以及最終人類生物學的信息。

用於可再生生物燃料和生化生產的非常規酵母的基因工程

解脂耶氏酵母是一種非致病性，二態性和嚴格需氧的酵母菌種。由於其獨特的生理特徵和代謝特性，這種非常規酵母不僅是研究真菌分化的基本性質的良好模型，而且還是生化生產和各種生物技術應用的有希望的微生物平台，需要廣泛的基因敲除技術。然而，解脂耶氏酵母的基因操作由於缺乏有效和穩定的遺傳轉化系統以及非常高的非同源重組率而受到限制，這主要歸因於KU70基因。研究人員報告了一種簡便而快速的方案，用於解脂耶氏酵母Po1g中的有效遺傳轉化和基因缺失。首先，建立了將外源DNA有效轉化為解脂耶氏酵母Po1g的方案。其次，為了獲得用於進一步刪除靶基因提高的雙交換同源重組率，通過轉化攜帶1kb同源臂的破壞盒來刪除KU70基因。第三，為了證明在刪除KU70基因後提高的基因刪除效率，研究人員在KU70敲除平台菌株上使用相同的程序分別刪除了11個編碼醇脱氫酶和醇氧化酶的靶基因。觀察到，精確同源重組的比率從缺失Po1g中的KU70基因的小於0.5％顯着增加到針對Po1gKU70Δ中的11個靶基因的單基因缺失的33％-71％。構建攜帶潮黴素B抗性標記和Cre/LoxP系統的複製質粒，並通過表達Cre重組酶最終去除酵母敲除菌株中的選擇標記基因，以促進多輪靶向遺傳操作。所得的單基因缺失突變體在生物燃料和生物化學的生產中具有潛在的應用。

RNA引導的Cas9在酵母基因組中的組合代謝途徑組裝

釀酒酵母是生產穀物和纖維素乙醇，異丁醇，丁二醇，類異戊二烯和其他化學品的重要工業平台。成功生產菌株的構建通常涉及多個基因敲除和表達盒的染色體整合，以重定向代謝通量，以將糖和其他原料轉化為所需產品。基於RNA指導的Cas9基因組編輯已在包括釀酒酵母在內的許多原核和真核宿主中得到證實，在其中它們還被用作代謝工程的工具。為了擴展RNA引導的Cas9作為代謝途徑構建工具的利用，研究人員展示了多達17個重疊的編碼β-胡蘿蔔素生物合成途徑的DNA片段的直接組裝和染色體整合。此外，研究人員為β-胡蘿蔔素生物合成途徑生成了組合菌株文庫，直接整合到酵母基因組中以創建多樣化的菌株文庫。這樣就可以在穩定的染色體整合菌株中篩選組合文庫，以快速提高產品滴度。這種途徑組裝的組合方法將大大加快目前S代謝工程的速度。釀酒酵母作為工業平台，並增加了可以同時進行酶篩選，表達優化和蛋白質工程評估的菌株數量，以實現新型工業發酵產品商業化所需的滴度，速率和產量。

開發用於CRISPR/Cas9系統的擬南芥酵母Rhodosporidium Toruloides基因組編輯

已研究了擔子菌酵母圓核假單胞菌（R.

toruloides）作為生產脂質和類胡蘿蔔素的有希望的宿主。然而，由於缺乏有效的遺傳工具，對該酵母進行合理的操作仍然很困難。描述了簇狀規則間隔的短迴文重複序列（CRISPR/Cas9）系統的開發，用於在擬南芥中進行基因組編輯。首先，通過將含有密碼子優化的Cas9基因的盒整合到基因組中，產生具有足夠產量的金黃色葡萄球菌 Cas9蛋白的擬南芥菌株。同時，鑑定了兩個U6基因，預測了兩個U6啓動子，並確認了具有U6b啓動子的單向導RNA（sgRNA）的轉錄更好。接下來，設計分別針對CRTI，CAR2和CLYBL基因的sgRNA盒，將其轉化為表達Cas9的菌株，並發現成功插入和缺失（indel）突變的轉化子超過60％。此外，當sgRNA盒包含側翼為基因CRTI的兩個同源臂的供體DNA時，基因敲除會通過同源重組發生。因此，CRISPR/Cas9系統現在已被建立為魯氏擬南芥中強大的基因組編輯工具，這應有助於功能基因組研究和先進的細胞工廠發展。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

Reference

Yu A Q , Pratomo N , Ng T K , et al. Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production[J]. Journal of Visualized Experiments, 2016(115).

EauClaire, Steve, Zhang, et al. Combinatorial metabolic pathway assembly in the yeast genome with RNA-guided Cas9.[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2016.

Xiang, Jiao, Yue,et al. Developing a CRISPR/Cas9 system for genome editing in the basidiomycetous yeast Rhodosporidium toruloides.[J]. Biotechnology Journal, 2019.

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