Crispr基因敲除細胞系系統分析-源井生物_風聞

基因敲除細胞系的前提條件性，是要一種用於消除某些組織（例如肝臟）中特定基因的技術。該技術對於研究個體基因在活生物體中的作用非常廣泛。它與傳統的基因敲除技術不同，因為它在特定的時間針對特定的基因，而不是從一開始就將其清除。而基因敲除技術的使用消除了許多傳統基因敲除的副作用。在傳統的基因敲除中，胚胎可能由於基因突變而死亡，這使科學家無法研究成年的基因細胞。然而某些細胞組織即使可以敲除也不能單獨進行研究，因此該細胞在某些組織中必須是無活性的，而在其他組織中必須保持活性。利用這項技術，科學家可以在發育的特定階段中基因敲除細胞系，並研究敲除一個組織中內的基因如何影響其他組織中的相同基因。

Easi-CRISPR用於使用長ssDNA****供體創建敲入和條件敲除小鼠模型

基於CRISPR/Cas9的基因組編輯可以通過破壞基因序列輕鬆產生敲除小鼠的原代細胞，但是創建需要插入外源DNA（敲入）或替換基因組片段的模型效率非常低。這項研究中使用的大多數小鼠模型都涉及敲入（報道基因或重組酶）或基因替換（例如，含有側翼為LoxP位點的外顯子條件敲除等位基因）。已經報告了創建此模型的一些方法。這些方法使用雙鏈DNA作為供體，但效率通常為1-10％，因此不適合常規使用。研究人員最近證明，長單鏈DNA（ssDNA）可以是非常有效敲除供體，無論是插入還是基因替換。研究人員稱此方法為ssDNA

insert-CRISPR（Easi-CRISPR）的有效補充，因為它是一種有效的技術（效率通常為30-60％，在某些情況下可達100％）。該協議將花費大約2個月的時間來生產創始人老鼠，從而研究起敲除小鼠的原代細胞和編輯。

CRISPR-Cas9****核酸內切酶產生了基因敲除細胞系的條件，揭示了冠心病在秀麗隱杆線蟲神經發育中的作用

基因敲除動物的細胞系是研究細胞和發育生物學基本機制的寶貴工具。研究人員通過操縱秀麗隱杆線蟲的體細胞譜系中RNA指導的DNA核酸內切酶CRISPR-Cas9的表達，開發了一種條件敲除策略。研究人員表明，這種CRISPR-Cas9體細胞技術提供了一種快速有效的方法來在不同發育階段的各種細胞類型中產生條件基因敲除。此外，研究人員證明，這種方法優於我們最近開發的體細胞TALEN技術，並且可以一步生成多個基因細胞的條件敲除。通過將這些技術與活細胞成像相結合，研究人員表明，與人類神經行為功能有異常相關的必需胚胎基因Coronin可以調節神經母細胞遷移和神經形成過程中中央線蟲的肌動蛋白組織。和細胞形態。研究人員提出，體細胞CRISPR-Cas9平台中特別適合基因編輯條件的生物醫學研究。

使用誘導性端粒**/掩蔽蛋白CRISPR/Cas9敲除細胞對人端粒功能障礙進行的系統分析**

CRISPR/Cas9基因敲除技術可以使用人體細胞對人類基因進行有效的功能喪失分析。但是，必需基因的研究需要條件敲除（KO）細胞。研究人員描述了可以誘導CRISPR KO人類細胞系產生的端粒/shelterin複合物。 TRF1，TRF2，RAP1，TIN2，TPP1和POT1的亞基與端粒相互作用或可以與其他端粒分離。幾個亞基的純合滅活在小鼠中是致命的。關於人類端粒調節子功能喪失的大多數研究都依賴於RNA干擾介導的基因敲除，這有其自身的侷限性。我們的可誘導CRISPR方法使我們能夠更方便地獲得大量細胞系，其中必需的端粒調節劑已被滅活，用於生化和分子研究。我們的系統分析揭示了人類和小鼠端粒蛋白在DNA損傷反應，端粒長度和代謝控制方面的功能差異，從而為維持端粒提供了新的見解。

Ubigene的目標是簡化基因組編輯。Ubigene開發了CRISPR-U™（基於CRISPR/Cas9技術），在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR/Cas9更有效，而CRISPR-U™可以大大提高同源重組的效率並輕鬆實現敲除（體內）（體外）點突變（PM）和敲入（KI）。藉助CRISPR-U™，Ubigene已成功編輯了100多個細胞繫上的基因。

Reference

Miura H, Quadros R M, Gurumurthy C B, et al. Easi -CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors[J]. Nature Protocols, 2018, 13(1): 195-215.

Shen Z, Zhang X, Chai Y, et al. Conditional knockouts generated by engineered CRISPR-Cas9 endonuclease reveal the roles of coronin in C. elegans neural development.[J]. Developmental Cell, 2014, 30(5): 625-636.

Kim H, Li F, He Q, et al. Systematic analysis of human telomeric dysfunction using inducible telosome/shelterin CRISPR/Cas9  knockout cells[J]. Cell discovery, 2017, 3(1).

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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