CRISPR / Cas9基因敲除CHO細胞系的作用分析-源井生物_風聞

“基因敲除CHO細胞系”（中國倉鼠卵巢細胞）是源自中國倉鼠卵巢細胞的實驗室培養的細胞系技術。中國倉鼠是一種流行的實驗室哺乳動物，部分原因是它們的體積小且染色體數少，使其成為組織培養和放射學研究的良好模型。CHO細胞是生物學，醫學和藥學研究中常用的哺乳動物細胞模型。另外，它們通常用於商業目的以產生治療性重組蛋白。對治療性蛋白質的需求不斷增長，導致了在CHO表達系統中促進高質量和高生產率的技術的發展。已經建立了CHO培養過程，使用CHO細胞生產治療性蛋白質的成本與微生物培養的成本相當。

使用CRISPR/Cas9和熒光富集產生三重敲除CHO細胞系

先前已經證明，CRISPR / Cas9基因編輯技術是用於CHO細胞基因破壞的有效工具。穩定的細胞系在這項研究中，研究人員通過在CHO細胞的多個環境被同時破壞FUT8，BAK和BAX，進一步證明了CRISPR/Cas9基因組編輯的適用性和效率。為了從轉染的細胞庫中分離出表達Cas9的細胞，GFP通過2A肽與Cas9核酸酶連接。使用這種方法，在三個基因組位點產生的平均插入缺失頻率從富集前的11％增加到富集後的68％。儘管在富集的細胞池中存在大量的基因組編輯事件，但從脱靶預測然後進行深度測序均未觀察到明顯的脱靶效應。對富集的多重細胞進行單細胞分選，並對97個克隆進行深測序，發現有4個單基因，23個雙基因和34個三基因破壞的細胞系。如預期所選的，對選定的潛在三方敲除克隆的進一步表徵證實了Bak和Bax蛋白的去除並破壞了巖藻糖基化活性。與野生型CHO-S細胞相比，敲除細胞系顯示出對凋亡的增強抵抗力。總之，與CRISPR/Cas9的多路複用可以進一步加速CHO細胞中的基因組工程工作。

敲除難以去除的CHO宿主細胞蛋白脂蛋白脂肪酶，以提高單克隆抗體製劑中山梨酸酯的穩定性

儘管大多數宿主細胞蛋白（HCP）雜質在典型的下游純化過程中已被有效去除，但是一小部分HCP尤其具有挑戰性。先前的研究已經確定了由於多種原因而具有挑戰性的HCP。脂蛋白脂肪酶（LPL）是中國倉鼠卵巢（CHO）HCP，具有水解甘油三酸酯中的酯的功能。它是先前研究中確定的十種HCP之一，很容易保留在下游的加工中。由於聚山梨酯和甘油三酸酯之間的結構相似性，LPL可能會使最終產品配方中的聚山梨酯80（PS-80）和聚山梨酯20（PS-20）降解。在這項工作中，發現重組LPL在一系列mAb製劑的典型溶液條件下對PS-80和PS-20具有酶促活性。使用CRISPR和TALEN技術創建LPL基因敲除CHO細胞。與野生型樣品相比，所得細胞培養物收穫物證明聚山梨酯降解顯着降低，而對細胞生存力沒有顯着影響。

優化CRISPR / Cas9策略，可在CHO細胞中進行同源性導向的轉基因多靶點整合

特定於站點的整合已成為一種精準的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系工程和可預測的細胞系發育（CLD）的前途和策略中。具有同源性定向修復（HDR）途徑的CRISPR / Cas9能夠將轉基因精確整合到目標基因組位點中。然而，對轉基因的HDR介導的靶向整合（TI）固有的頑固性導致靶向效率低下，因此需要選擇過程才能在CHO細胞中找到靶向整合體。研究人員使用基於啓動子-Trap的單或雙敲入（KI）監視系統探索了幾個影響目標效率的參數。與傳統的環形供體質粒相比，增加了單向導RNA識別序列對供體模板設計進行的簡單更改，可顯着提高KI效率（2.9–36.0倍），取決於整合位點和細胞培養模式，可提高KI效率。此外，順序和同時進行的KI策略使我們無需額外的富集程序即可獲得約1-4％的雙KI細胞羣體。因此，這種簡單的優化策略不僅可以在CHO細胞中實現高效的CRISPR/Cas9介導的TI，而且還為在一個實驗步驟中多重KI的適用性鋪平了道路，而無需順序和獨立的CHO-CLD程序。

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Reference

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基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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