基因編輯iPSCS敲除技術原理與潛在的治療應用-源井生物_風聞

誘導多能幹細胞（iPS細胞），是一種從成年（成熟）細胞生成的未成熟細胞，已經恢復了分化為體內任何類型細胞的能力。誘導的多能幹細胞（iPS細胞）不同於胚胎幹細胞（ES細胞），後者形成胚胎的內部細胞團，但也是多能的和原代細胞類似，最終導致構成人體的所有細胞類型。誘導多能細胞最早是在2006年由日本醫師和研究員Shinya

Yamanaka及其同事描述的。最初的實驗是通過使用小鼠細胞進行的。然而，第二年，Yamanaka成功地從人成年成纖維細胞中獲得了iPS細胞。在此之前，只能從早期人類胚胎中分離出人類幹細胞。因此，iPS細胞的一個重要特徵是它們的產生不需要胚胎，而胚胎的使用充滿了倫理問題。

使用CRISPR-Cas9對血友病患者自發iPSC中大因子VIII基因染色體倒置的功能校正

血友病A是由F8基因突變引起的X連鎖遺傳病，該基因編碼凝血因子VIII。在所有嚴重的血友病A病例中，幾乎有一半的病例是由兩個總的（140 kbp或600 kbp）染色體倒置導致的，分別涉及F8基因的內含子1和22。研究人員從具有這些反轉基因型的患者中衍生出誘導多能幹細胞（iPSC），並使用CRISPR-Cas9核酸酶將這些染色體片段恢復為WT狀態。研究人員基於全基因組測序或靶向深度測序，分離了頻率高達6.7％的經反向校正的iPSC，而沒有可檢測到的脱靶突變。在其他致命的血友病小鼠模型中，從校正的iPSC分化出來的內皮細胞表達F8基因並在功能上拯救了VIII因子缺乏症。因此，結果為患者來源的iPSC中大染色體重排的功能校正提供了原理證明，並提出了潛在的治療應用。

使用CRISPR-Cas9產生基因校正的自體iPSC來治療遺傳性視網膜變性

患者來源的誘導性多能幹細胞（iPSC）對於自體細胞替代具有廣闊的前景。但是，對於許多遺傳性疾病，治療可能需要在移植前進行基因修復。基因編輯技術對該應用程序很有用。這項研究的目的是開發CRISPR-Cas9介導的基因組編輯策略，以靶向和糾正患者衍生的iPSC中三種最常見的致病變體類型：（1）外顯子，（2）深度內含子（3)主導功能。研究人員開發了針對雄性生殖細胞相關激酶（MAK）外顯子9的純合Alu插入的同源性定向修復策略，並證明了患者細胞中視網膜轉錄本和蛋白質的還原。研究人員產生了一種CRISPR-Cas9介導的非同源末端連接（NHEJ）方法，以切除導致Leber先天性黑病的主要因素，CEP290中的IVS26隱剪突變，並證明了患者iPSC中轉錄本和蛋白質的校正。最後，研究人員設計了等位基因特異性CRISPR嚮導，可選擇性地靶向Pro23His視紫紅質（RHO）突變體等位基因，在將其分別遞送至患者iPSC和體內視網膜後，產生了移碼和過早的終止，可阻止該疾病的轉錄-導致變體。在這項研究中開發的策略將被證明對糾正導致的遺傳性視網膜變性基因中的多種遺傳變異有用。

CRISPR-Cas9靶向破壞HLA基因以產生具有增強的免疫相容性的iPSC

誘導多能幹細胞（iPSC）在再生醫學應用中具有巨大潛力。然而，由HLA失配引起的免疫排斥是一個問題。

B2M基因敲除和HLA純合iPSC羣體可以解決此問題，但是前一種方法可能誘導NK細胞活性並且不能呈遞抗原，而為後一種方法招募稀少的體則是一個挑戰。研究人員展示了兩種用於製備免疫相容性供體iPSC的基因組編輯策略。首先，研究人員通過對HLA雜合iPSC進行等位基因特異編輯，生成了HLA偽純合iPSC。其次，研究人員破壞了HLA-A和-B等位的基因，以抑制NK細胞反應，同時保持抗原呈遞，從而創建了具有HLA-C保留能力的iPSC。

HLA-C保留的IPSC可以在體內和體外逃逸T細胞和NK細胞。研究人員估計，結合HLA II類基因敲除的12種HLA-C保留的iPSC在免疫學上與世界90％以上的人口相容，極大地促進了基於iPSC的再生醫學的應用。

Ubigene的目標是簡化基因組編輯。我們已經開發了CRISPR-U™（基於CRISPR / Cas9技術），在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR / Cas9更高效。 CRISPR-U™可以大大提高同源重組的效率，並在體內和體外輕鬆實現敲除（KO），點突變（PM）和敲入（KI）。藉助CRISPR-U™，Ubigene已成功編輯了100多個細胞繫上的基因。

Reference

Park C Y, Kim D H, Son J S, et al. Functional Correction of Large Factor VIII Gene Chromosomal Inversions in Hemophilia A Patient-Derived iPSCs Using CRISPR-Cas9[J]. Cell Stem Cell, 2015, 17(2): 213-220.

Burnight E R, Gupta M, Wiley L A, et al. Using CRISPR-Cas9 to Generate Gene-Corrected Autologous iPSCs for the Treatment of Inherited Retinal Degeneration[J]. Molecular Therapy, 2017, 25(9): 1999-2013.

Xu H, Wang B, Ono M, et al. Targeted Disruption of HLA Genes via CRISPR-Cas9 Generates iPSCs with Enhanced Immune Compatibility[J]. Cell Stem Cell, 2019, 24(4).

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

註明 | 文章是源井生物原創，轉載請註明。

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