一篇論文背後的故事_風聞
返朴-返朴官方账号-关注返朴（ID：fanpu2019）,阅读更多！2020-10-18 22:37
每一個科學難題的背後都有一盞點亮的明燈，只不過是這盞明燈被幽閉在不透光的密室裏，使得外頭的人無從知曉。探索者的努力無非是在厚薄不等的牆上砸開一條裂縫，直到看見裏面透出的一線光明。
撰文 | 翁羽翔(中國科學院物理研究所 軟物質物理實驗室)
來源：中國物理學會期刊網
2020年6月23日，《中國科學：化學》在線發表了題為“Dynamical and Allosteric Regulation of Photoprotection in Light Harvesting Complex II (高等植物光系統II捕光天線蛋白實現光保護功能的動態及變構調控) ”一文[1]，一項馬拉松式的研究工作終於暫告一段落。先前和朋友聊起這篇論文探索過程之艱辛、發表過程之坎坷時，朋友極力鼓勵我把這段經歷寫成文字，也許對年輕的研究者有所啓迪和借鑑。然而在提筆的時候，腦海中總有一個揮之不去的名字：卞和。《卞和獻璧》是一個大家耳熟能詳的故事，是中學課文中的一篇文言文，講述的是卞和獻寶的經歷。卞和在楚厲王在位的時候，認定自己找到的璞石是一塊稀世寶玉，就把它獻給厲王。厲王命玉工看後認為只不過是一塊普通的石頭，卞和由此落個欺君之罪而失去一條腿。來年卞和不服，又來獻寶，結果失去了另一條腿。厲王死後文王繼位。新君繼位，革故鼎新，於是便派人去找卞和，此時的他已在山中哭泣了三日，淚盡繼之以血。文王令玉工剖璞驗石，這才有傳於後世的和氏璧。儘管卞和的執着為後人所稱道，但也引來後人的質疑：(1)卞和憑什麼堅信他撿到的石頭就是寶玉？就憑他看到鳳凰曾經棲落在這塊石頭上？(2)卞和為什麼非要去獻寶？(3)卞和為什麼不自己找玉工先剖析璞石，而非要等君王身邊的玉工來評判？雖然卞和最後為自己洗淨了冤屈，但結果還是讓人覺得有些僥倖。在我看來，與其説卞和只是為了獻寶，還不如説是在堅守他自己的信念：鳳凰非寶石不棲。儘管現在看來這一信念有點可笑，可仔細想來，我們自己這些現代人身上或多或少也能夠折射出卞和的影子。
2 強光下的光合作用——一個少年的偏見
江南的仲夏，田野中墨綠色的水稻在正午的烈日下拔節、揚花、灌漿，直到如金粒般的成熟。辛勤勞作的農人難得有一段清閒的日子，企盼着來日有充足的陽光，好去充孕每一株穀穗。
葉簌知風起，蛙鳴道雨停。
樂極農閒月，
燈下伴書琴。
這樣的日子，分不出是唐是宋，還是元、明、清。直到西學漸近，科學昌明的年代。如果時光能夠穿越，我一定要去喚醒那位面帶飢色的少年：他經常在仲夏的烈日下衝着田野痴痴地發笑，堅信每一株水稻正在烈日下不停地進行光合作用，而光合作用的名詞也是不久前剛從他的老師那兒聽來的。烈日普照—光合作用—糧食豐收—碗中的白米飯，一幅多麼激動人心的畫卷，難怪少年被這正午的烈日陶醉了。
然而，現代科學研究表明：在自然環境中，太陽光的輻照強度可以在短時間內呈現出十幾倍的差異。植物不僅要在低光照條件下實現高效捕光，並把激發能傳遞給反應中心進行後續的光能—化學能轉換，還要在高光強條件下將過量激發能以熱的形式耗散掉，從而切斷能量傳遞通路，避免過量光能造成的輻射損傷，實現光保護功能。也就是説，在仲夏正午的陽光下，水稻還有其他植物是不進行光合作用的，而是忙着自救，避免過量光能對反應中心帶來的損傷！
3 高等植物主要捕光複合物的“中國晶體”——於無聲處聽驚雷
現代科學前沿領域的思想和實驗探索工具越來越複雜，分工也越來越細。頂尖的科研成果很少會出自寒門，大都得益於優良的學術傳承和發揚光大。中國科學院植物研究所在植物光合作用生物化學研究領域至少已歷經兩代人的堅守和努力——湯佩松院士和匡廷雲院士。中國科學院生物物理研究所的X射線晶體學研究方向則以人工合成胰島素的晶體結構解析而揚名於世，這一學派代表人物有樑棟才院士、常文瑞院士、饒子和院士。這兩大學派珠聯璧合，催生了中國光合膜蛋白原子級分辨率晶體結構解析的學術高地。匡院士作為第一批國家重點基礎研究發展規劃項目 (973項目，1998—2002年) “光合作用高效光能轉化的機理及其在農業中的應用”的首席科學家，對我國的光合作用基礎研究起到了組織和推進作用。作為該項目的代表性成果，2004年3月18日， 常文瑞院士和匡廷雲院士領導的團隊在 Nature 上以主題論文的方式發表了“菠菜主要捕光複合物 (LHCII) 2.72 Å分辨率的晶體結構”的學術論[2]，這是國際上第一個用X射線晶體學方法解析的綠色植物捕光複合物高分辨率空間結構。
論文發表之前，筆者有幸參加了在香山雙清別墅舉辦的項目結題交流會。因為參加過幾次年度工作交流會，對一些課題的進展有大致的瞭解。菠菜主要捕光複合物晶體結構解析的工作進展照例由常先生作彙報。先前幾次會議對常先生的印象是不苟言笑，作報告有板有眼，喜怒不形於色，當然也給年輕人留下了一種威嚴的感覺。
和往常彙報的風格一樣，常先生展示了 LHCII 的針狀晶體和收集到的X射線衍射數據。記得上一次彙報的時候，常先生講到這，底下的聽眾一陣激動，當大家期待着常先生給出晶體結構的時候，他非常平靜地説道：“晶體在X射線的輻照下，崩潰了！”底下又是一陣惋惜的騷動。
這次常先生講到這兒的時候，大家都有心理準備，大不了晶體又崩潰了！可這次沒有，常先生先不緊不慢地給大家展示了 LHCII 具有和20面體病毒一樣空間點羣的單晶元胞結構，然後才不温不火地展示了 LHCII 原子級分辨率的晶體結構，當時整個會場被鎮住了，足足有大約5分鐘的時間會場上鴉雀無聲，我是第一個從這種震撼中清醒過來的，便帶頭鼓起掌來。在持續的掌聲中，常先生還是一言不發地站在講台上，直到匡先生熱淚盈眶地拿起了話筒，開始講述箇中的曲折，而我在底下悄悄地按下了快門 (圖1) 。會後常先生專門打電話叮囑我在論文正式發表前，不要外傳有關晶體結構的照片。
LHCII 原子級分辨率晶體結構的解析是中國科學家的驕傲。匡廷雲院士在不同的場合提到 LHCII 的晶體結構被國外同行科學家稱為“中國晶體”，以此勉勵國內從事物理、化學與生物學交叉研究的學者努力將該蛋白質的工作機理弄清楚，做出與“中國晶體”相稱的“中國機理”來。這便是“中國晶體”和“中國機理”説法的由來。對於“中國晶體”和“中國機理”的説法，物理學家戴希教授認為，不宜人為地用狹隘的地域概念去割裂科學，本人深以為然。對於光合作用研究起步較晚的我國，這樣的説法更側重於對後來者的激勵吧，現代科學的發展離不開國際間的交流和合作！對於物理所人，衝擊“中國機理”便成了一項當仁不讓的使命。
4 三人成一眾，聚散靠温度——一個令人心動的猜想
LHCII 在自然界主要以三聚體的形式存在，可以簡化成三個外切的橢圓(圖2(b)中綠色填充部分)。其中，藍色三聯小球表示鑲嵌在蛋白中的葉綠素 b，相應的紅色三聯小球為葉綠素 a。如果用虛線畫出兩個圓環分別表示內圈和外圈的相互作用色素分子，可以看出，環上的色素分子排列方式與光合細菌捕光天線中排列成圓環狀的細菌葉綠素分子 (圖2(a)) 有很大的相似性。對於光合細菌環狀捕光天線的量子力學研究表明，細菌葉綠素分子通過偶極相互作用，形成電子態相干的離域態，可以向鄰近的捕光天線進行無方向限制的高效傳能[3]。
2005年初，在與中國科學院化學研究所張建平研究員的討論中碰撞出了思想火花，受到光合細菌捕光天線分子結構的啓發，高等植物三聚體的兩個色素環會不會也有這樣的功能？內環色素分子可將能量傳遞給外環，外環色素分子和相鄰的 LHCII 三聚體之間可進行無方向限制的高效傳能。如果温度升高，三聚體可能發生解聚，傳能環被拆解，從而阻斷傳能通道，實現光保護功能。等温度降低後三聚體結構又可以恢復，如此週而復始，實現高效捕光與光保護之間的可逆切換(圖2)。
上述想法簡單易懂，而且貌似不需要涉及過多的蛋白質動態結構細節，就很自然地把它作為創新點“具有生物活性功能的 LHCII 在類囊體膜中是以三聚體的方式存在的，我們擬將 LHCII 三聚體的動態聚合/解聚合作為研究 LHCII 通過蛋白質動態結構變化實現高效捕光功能和有效光保護功能之間切換的突破點”去申請國家項目，但是一直沒有申請成功。雖然這個激動人心的猜想到2017年才徹底破滅，但卻激勵了10餘年間不懈的探索和研究條件的積累。
5 CO中紅外激光器——有錢的玩錢，沒錢的玩命
1999年回到中國科學院物理研究所工作，當時尚未申請到百人計劃的支持。組裏最好的設備是先前三個組合買的一台進口YAG脈衝激光器，大家輪流使用。角落裏還有一台用紫色天鵝絨布覆蓋着的、由石英杜瓦瓶液氮浸式冷卻放電管構成的中紅外一氧化碳 (CO) 分子氣體激光器。這是傅克堅研究員 (傅作義先生女兒) 的課題組留下的[4]，閒置在那裏應該有5—6年之久，瞭解這台激光器的人都已經離開了這個實驗室。當時在思考如何利用現有的條件開展有意義的研究，而不至於虛度光陰。碰巧在海淀圖書城買到一本由國內多位著名科學家撰寫的《21世紀的100個科學難題》[5]，其中有一篇是中國科學院生物物理研究所王志珍院士 (後來有幸與其合作) 寫的文章“中心法則的空白——從新生肽到蛋白質”，談到“蛋白質摺疊問題”是科學難題，聯想到我在 Emory 大學做博後時認識的喬治亞理工學院 (Georgia Institute of Technology) Mostafa El-sayed 教授的博士生王建平，他當時正在開展利用脈衝升温—納秒時間分辨中紅外光譜研究蛋白質摺疊動力學，於是就下決心開展這個方向的研究。
第一件事是如何讓CO激光器運轉起來，在找不到知情者諮詢的情況下，想到去所科技檔案室碰碰運氣，看看有沒有相關的資料存檔。沒想到，李春芳老師居然從檔案室給了我一個厚厚的資料袋，裏面不但有研製任務書，還有圖紙及儀器驗收指標，關鍵還有這台設備的研製單位大連理工大學的聯繫人和電話。憑藉這個電話號碼，找到了大連理工大學的於清旭教授，從此開展了後來持續多年的CO激光器升級換代工作。2001年開始連續三年向自然科學基金委員會遞交應用脈衝升温—時間分辨中紅外激光光譜研究蛋白質動態結構的申請，直到第三次申請才終於獲得了面上基金的資助。多年後才知道，項目進入會評階段多虧了當時只有一面之緣的大連化學物理研究所李燦院士的支持。期間在於老師的指導下，學會了CO激光器的出光調試，但是這台老激光器一旦連續運行起來，問題便層出不窮，不是變壓器被燒壞，就是大電容被擊穿，而且激光穩定性差，就連真空橡膠抽氣管用幾回也會穿孔破裂，如此等等，不一而足。記得那年冬天，幾乎十個指頭都纏着膠布。有一次無意中看到一篇資料講到臭氧對人體皮膚的損害，聯想CO激光器放電後石英管中會殘存大量藍色的液態臭氧，不僅腐蝕人的皮膚，肯定也會腐蝕真空橡膠管，由此一舉解決了手指皸裂和真空橡膠管被腐蝕的問題。那段時間正好我父親來北京，很少有時間陪他出去轉。老人家從鄉下來，滿懷希望地想見識一下在中國科學院物理研究所就職、多年遊學海外的“海歸學子”。看到我每天早出晚歸，忙忙碌碌的樣子，父親很是失望，在我家住了一個月就回去了。臨走時扔下一句話：“都以為你是個海歸，我看你就是一個打工仔”。是的，對不起了父親，我本來就是一個打工仔，不同的是，這回是為自己打工，為自己的國家打工。
還有一個問題是光路的實時調節。紅外激光看不見，因此設計激光器時在鍍金的端面反射鏡上開了一個 5 mm 的小孔，引入氦氖激光作為指示光。激光放電管由中間的正極 (零電位) 和石英管兩端各一個負極構成。正負電極之間的電壓為7千多伏。接線柱在激光器靠牆的一側，但裸露在空氣中，平時不會碰到接線柱。在調節諧振腔光路時，需要兩人配合，一人的手臂要從靠牆的一面空隙中伸到輸出鏡側的定位光闌處，通過開閉光闌查看指示光的位置，指揮另一人調節端面鏡的反射光路。實際操作中，我擔當“指揮員”的角色。為了安全起見，先在地上鋪上絕緣的膠墊，再穿上膠底拖鞋，心想即使碰到負極，身體也只不過是個等電勢體，應該不會發生什麼意外。在一次調光路過程中，我和張慶利同學(該方向第一個研究生)都穿着短袖。我左手臂無意中碰到電極，而恰在這個時候，張慶利的手臂碰到了我的右胳膊，頓時感覺到一股電流湧向心臟，引起心臟瘋狂地跳動，令人窒息。而這時左手腕帶的金屬表和皮膚之間也放起電來，除了藍色的電光外，還發出一股焦糊味。奇怪的是，張慶利居然一點感覺也沒有，原來是 7600 V 電壓通過他 (零電位) 把我給接地了！2006年在廈門大學召開的全國跨學科蛋白質大會上，我在報告中亮出了這句感悟：做科研是“有錢的玩錢，沒錢的玩命”，沒想到這成了那屆會議被引用最多的一句話。
6 畢業就業的壓力——一篇文章一條命
脈衝升温—納秒時間分辨紅外光譜研究蛋白質動態結構的原理是，紅外光譜能夠識別蛋白質的二級結構，如α-螺旋、β-摺疊、無規捲曲、環折結構及分子間氫鍵等。而激光脈衝升温方法可以給蛋白質一個快速的擾動，一般由脈寬為10 ns的脈衝激光激發水或氘代水的泛頻吸收，可在20 ns時間內引起體系約20 ℃的温升，比傳統的反應停留法測定蛋白質摺疊動力學的時間分辨率高出幾個數量級。然而常規的摻釹YAG激光器1.064 μm的基頻輸出無法直接用作加熱脈衝，必須經過一個以高壓氫氣為介質的拉曼頻移器，將基頻紅移到2 μm左右。拉曼頻移器看起來很簡單，在一段不鏽鋼管的兩端分別安裝上石英窗口。但要保證其在幾十個大氣壓下安全工作，誰也沒有把握。2002年訪問日本東京大學的一個光譜實驗室，聽説一個充有80個大氣壓的拉曼頻移器出了事故，石英窗片被高壓氣體推出，在對面的牆上砸出了一個大洞，幸虧沒有傷着人。儘管有風險，還是想由自己設計加工，並就此事請教許祖彥院士。許先生告訴我們，清華大學的婁彩雲教授做過拉曼頻移器用以產生通訊波段的激光 (1.54 μm，用甲烷做介質)。就這樣從婁老師那裏拿到了拉曼頻移器，額定安全工作氣壓為20個大氣壓。實驗中激光轉換效率太低，王莉同學 (北京理工大學聯合培養的研究生) 把氣體池加長，又在婁老師的指導下提心吊膽地把氣壓一點點提高到30個大氣壓，總算滿足了實驗要求。這時張慶利同學也把CO穩定性提高到了較為滿意的水平，與加熱脈衝激光聯用後，實現了探測光吸收變化率 (ΔOD) 測量精度為10^（-3）的基本要求[6]。當時經費缺乏，連王莉的工資都開不出來了，於是硬着頭皮去找楊國楨院士幫我想想辦法，以解燃眉之急。沒想到楊先生聽完我説的困難後，爽快地把他當年的院士個人支配的創新經費（3萬元）轉給了我。
2006年葉滿萍同學開始了LHCII三聚體的變温紅外和脈衝—升温時間分辨紅外光譜研究，樣品通過匡先生介紹由中國科學院植物研究所王可賓老師提供。當時面臨的最大問題是單波長掃描測量的瞬態紅外光譜重複性不好，於是將紅外光分成兩路，一路探測樣品，一路作為參考光，實時扣除CO激光強度抖動，儘管數據質量明顯提高，但重現性還是差強人意。最後只好從幾十套瞬態光譜數據中挑出幾套自認為可靠性高的進行平均，但仍然難以確定光譜測量的準確性。2008年5月，葉滿萍畢業並聯繫好去東京大學做博士後，按計劃9月份去日本。看着這一堆尚未有頭緒的數據，就和她商量，能否再利用去日本前這段空檔時間，多重複幾套數據，給出一個可信的結果？得到的答覆是：“從6月6號開始，我已經不是物理所的人了！”，言外之意是老師的指揮棒失靈了。儘管回答讓我感到有些突然，冷靜下來還是深刻反思一下為什麼會這樣？連實驗技能已經很熟練的學生也在刻意迴避和逃離這個課題，換個新手會有改善嗎？答案是否定的，仔細研究實驗數據後，得出的結論是，測量精度必須提高一個數量級，即達到10^（-4）ΔOD 才能夠獲得可信的數據！沒有別的捷徑，只能改造升級實驗設備！而且必須拋棄使用拉曼頻移器這一通用做法。因為實驗發現由於高能量激光對氣體池的加熱效應，導致拉曼頻移輸出光在空間位置的重現性差，進而導致加熱激光和探測光焦點在樣品中的空間重合無法保障。另外CO激光輸出功率的穩定性也有待於進一步提高。新的方案是將加熱脈衝改用摻鈥的YAG激光，直接獲得2 μm的基頻輸出。但是這種激光器沒有商用產品，要自己研發。
2008年10月獲得了中科院重點儀器研發項目的資助，其中研製摻鈥YAG激光器的工作由中國科學院安徽光學精密機械研究所的合作者承擔，新一代脈衝升温—納秒時間分辨中紅外瞬態吸收光譜儀的調試工作由李得勇同學負責。記得第一次在新的設備上看到瞬態信號時，原來的熱切希望被活生生地澆滅了：儀器的電磁干擾信號居然高達1.5 V，主要來自於鈥激光電源。我把多年積累的經驗用上後，總算把噪聲降到了10 mV的水平，然後和李得勇講，10 mV的噪聲水平是我做博士年代的水平，20多年過去了，技術方法總歸有很大的長進吧，下面就看你的了，我的要求是毫伏量級。經過各種試錯(trial-and-error)，終於實現了這個目標[7]。
2015年中國科學院物理研究所科研簡報“高精度脈衝升温—納秒時間分辨中紅外瞬態光譜儀的成功研製”寫到：2015年5月27日，Review of Scientific Instruments發表了中國科學院物理研究所軟物質院重點實驗室翁羽翔研究組的一篇題為 “A Q-switched Ho: YAG laser assisted nanosecond time resolved T-jump transient mid-IR absorbance spectroscopy with high sensitivity”的儀器研製論文[8]，報道了新一代具有國際先進水平的脈衝升温—納秒時間分辨中紅外吸收差光譜儀的成功研製；包括研製高穩定連續輸出可調諧一氧化碳中紅外激光探測光源，以及研製新型的脈衝激光加熱光源，即空間模式穩定、輸出能量穩定的納秒調Q 的Ho: YAG 脈衝近紅外激光光源 (2.1 μm，與中國科學院安徽光學精密機械研究所吳先友研究員合作) 。該設備對蛋白質細胞色素c的脈衝升温—時間分辨中紅外光譜測量結果表明，在蛋白質酰胺 I’光譜範圍 (1600-1700 cm^（-1）) 內達到的平均測量精度為2×10^（-4） ΔOD。簡報的開頭是這樣寫的：“十年磨一劍，不敢試鋒芒，再磨十年劍，泰山石敢擋”。現在看來LHCII就是一塊用來試劍的泰山石。
和李得勇同學同年入所的李姍姍同學則投入了LHCII的研究工作中。由於研究工作一直沒有獲得實質性的結果，也不好意思再向植物所要樣品了，最好的解決方案是自己能夠提取樣品，並由此掌握提取蛋白樣品過程中所添加的試劑成份和含量。幸運的是，中國石油大學黃島校區黃方教授組裏的劉雙老師願意教我們，李姍姍就在那裏學會了從菠菜葉片中提取LHCII的實驗方法。由於儀器研製過程中碰到許多預想不到的困難，李姍姍沒有等到新的設備，而LHCII穩態光譜的數據尚不能夠説明問題，她離畢業要求還差一篇論文，就提出把LHCII的初步結果整理後投給國內的期刊，我沒有答應。在延期畢業的日子裏，李姍姍只好應用舊的脈衝升温—時間分辨中紅外光譜儀研究北京大學生命科學學院昌增益教授提供的熱休克蛋白，在修改稿返回給Scientific Report 編輯部漫長的三週時間等待中，延期畢業、就業競爭以及生活與家庭，似乎所有的成功與否都維繫在一篇論文是否被接收上，來自數方面的壓力差一點將她壓垮了。差不多是第三週的一個晚上，晚飯後照例查一查郵件，當看到了編輯部的接收函時，便一下子從椅子上跳了起來，大聲嚷嚷“接收啦！接收啦！”，以致我太太跑過來看到我當時的情形，冷冷地説了一句“你們這些搞科研的，一個個像范進中舉似的，不就一篇文章，至於嗎？”，我當時的回答是：“你知道嗎？一篇文章一條命！”
7 結識高加力教授——無心插柳的機緣
美國明尼蘇達大學化學系和超算中心的高加力教授是分子動力學模擬研究的專家，是分子動力學模擬的鼻祖、諾貝爾化學獎得主哈佛大學Martin Karplus教授的高足。我和他在2015年基金委物理化學處重點項目答辯會上初次見面，高老師來做申請答辯，他與吉林大學理論化學研究所開展合作研究工作，我是當時的評審專家。那年評審會印象深刻，年輕學者如復旦大學的劉志攀教授等勝出，而兩員老將高老師還有中國科學技術大學的嚴以京教授則鎩羽而歸。第二年高老師繼續參加答辯，項目是應用分子動力學模擬的方法計算蛋白質二級結構的紅外光譜，精度達到 1 cm^（-1）。這樣的申請報告對我而言不啻是高山流水之音。一激動，就做了一番即席發言。高老師那年終於拿到了項目，也許就是因為這一番發言，他便知道了國內有位運用紅外光譜解析蛋白質二級結構的翁羽翔。那年9月份，高老師和他的同事李輝教授突然造訪中國科學院物理研究所，就在物理所“總理咖啡屋”一敍。寒暄過後，就切入正題，我非常希望能夠和這樣的高人開展合作，於是就在咖啡屋的電子屏幕上給高老師介紹起了高等植物捕光天線的非光化學淬滅和我們的LHCII三聚體動態聚合/解聚調控的想法和研究進展。
在長期的進化中，植物發展出多種不同時間尺度與空間尺度的光保護機制，其中一種極為重要的機制叫做非光化學淬滅。非光化學淬滅發生的場所主要在類囊體膜，其淬滅位點包括光系統II主要捕光天線三聚體(LHCII trimer)與內周輔助捕光天線單體 (CP29、CP26、CP24)。捕光天線將過量的激發能在微秒時間尺度內以熱的形式耗散到環境中。尤其是捕光天線 LHCII，葉綠體中的含量最高約佔60%左右。晶體結構表明，LHCII單體包含6個葉綠素b，8個葉綠素a，與4個類胡蘿蔔素分子：兩個葉黃素 (lutein)，一個新葉黃素分子 (9’-cis Neaxanthin) 以及花葯黃素 (antheraxanthin，葉黃素循環的中間體) 。其中，LHCII 的蛋白質骨架由三段跨膜α-螺旋(A， B，C)構成，A和B呈剪叉式排列，交叉點由兩對帶正負電荷的氨基酸 (Arg70-Glu180，Glu65-Arg185) 通過形成鹽橋鎖定；類囊體腔側包含
8 痛苦不一定來自外部的打擊，但一定是內心希望的破滅
大約半年後，高加力教授第二次來到物理所，同樣在咖啡屋，只是演講的主角換成了高老師。高老師先展示了由24萬多個原子構成的LHCII三聚體、磷脂雙層膜和水分子構成的起始模型，然後演示了三聚體在高温下存在的一個開合運動，以及界面結合處水分子隨温度升高逐漸脱落的過程。當看到水分子的確隨着温度的升高從界面處脱落，這一點和實驗相符時，感到很高興。但接下來是令人困惑的問題：分子動力學模擬根本沒有揭示三聚體存在隨温度升高而解聚的跡象！結合植物所盧從明研究組2007年在Plant Physiology 上發表的實驗工作[9]，他們的結果表明LHCII三聚體隨着温度的升高確實發生了非光化學淬滅 (NPQ，non-photochemical quenching)，但沒有發生三聚體的解聚，而是熱誘導三聚體聚集過程。面對上述事實，不得不放下幻想，眼前一片迷茫，就像吹滅了十多年來照亮在黑暗中摸索的一盞油燈，此刻又重新陷入了徹底的黑暗。怎麼辦？投入了這麼多的人力、物力和時間，難道就此打住？冷靜下來後意識到原來為什麼這麼執着於這個想法，有深層次的原因，那就是對海量生物文獻的恐懼，因為只要物理模型成功，就沒有必要去了解生物學上的細節。在當前這種進退維谷的情形下，唯有紮紮實實地做好文獻調研，理清學術脈絡才有重新啓航的希望。接下來在查閲大量與熒光非光化學淬滅的相關文獻後認識到 (到論文發表為止，閲讀了近500篇論文) ，國際上對於NPQ的機制原來一直是有爭論的，儘管如此，以英國倫敦瑪麗皇后大學的Alexander Ruban教授為代表的一派提出的機理十分吸引人，也基本上處於主流地位，即一對交叉排列的葉黃素分子，各帶一個葉綠素a分子，形成兩對葉黃素—葉綠素色素對，當色素對中葉綠素與葉黃素分子間距較遠時，葉黃素分子將光譜藍區捕獲的能量傳給激發態能量較低的葉綠素分子，實現高效捕光；如果兩者靠得很近，則葉綠素將激發態能量傳給葉黃素的光學暗態，再由該暗態將激發能以熱的形式耗散掉，並把調控過程歸結於蛋白質的構象變化。然而蛋白質構象是如何實現這一“智能”調控的，仍然是一片空白。於是對LHCII變温紅外光譜進行仔細的解析，找出各個紅外吸收峯在變温過程中的相關性，結合晶體結構信息，儘量找出空間相鄰的二級結構的對應關係，希望在
繼2008年之後，終於又能夠應用升級改造後的設備再次回到葉滿萍同學中斷的地方。因此對於這套數據尤為期待，恰好葉滿萍這段時間也在組裏做訪問學者，無意中見證了激動人心的時刻。李昊對實驗數據質量的追求有一種“潔癖”，實驗細節把控極嚴。我在比較了幾屆學生的LHCII紅外光譜後發現，他做的數據質量最高，特別是氘代水溶劑中來自水的吸收干擾，他排除的最好。兩片光學窗片夾一層50 μm 厚的含表面活性劑的LHCII液體樣品，他在手套箱中裝樣，做的透明均勻，不含氣泡。記得這一貌似簡單的裝樣過程，先前有同學就是無法消除樣品池中的氣泡，連續做一個多月，哭着來找我，最後我也沒有想出好辦法，只能靠多裝樣，憑手氣。也正因為這種秉性，看他的數據要催得勤快點。李昊終於告訴我T-jump數據做好了，我在辦公室等了半天也沒收到郵件，忍不住跑到學生辦公室去找李昊。李昊沒在辦公室，我衝着葉滿萍喊了一嗓子 “李昊在哪，他把數據藏着掖着幹嘛？！”“他剛才還在，數據在電腦裏”，於是葉滿萍伸手去碰了一下李昊電腦的鼠標，喚醒了休眠中的屏幕，跳出一幅瞬態光譜圖，葉滿萍大叫一聲：“翁老師，你看李昊的光譜不是和我的一模一樣嗎！”我壓抑住心頭的狂喜，冷靜地説，你再比較一下你們倆的動力學數據的差異，這回葉滿萍服了：李昊的動力學給出了十分平滑的蛋白質去摺疊過程的曲線，而滿萍的動力學曲線則含有很大的振盪干擾，高下立判。磨刀做設備的功夫終於在這一刻收到了回報。
9 全原子分子動力學模擬——蛋白質動態結構的虛擬實驗
科研界做實驗的往往更相信自己的實驗結果，而把理論計算及分子動力學模擬等作為佐證實驗結果的錦上添花之作，我也深染這種習氣。
簡單地總結一下，全原子分子動力學模擬結果表明，在升温過程中，蛋白質部分結構單元會發生失水作用，導致結構單元間的疏水作用增強，
這次和高加力課題組實驗和理論的配合，徹底改變了我對分子動力學模擬的成見，可以説分子動力學模擬已經達到了蛋白質動態結構虛擬實驗的水平，當然人的因素永遠是第一位的。
10 熱、酸觸發的LHCII剪叉式升降運動實現高效捕光到能量淬滅的切換
我們的研究結果表明，LHCII恰如剪叉式升降機一樣的分子開關 (圖5) ，在熱效應或酸誘導的疏水作用下，觸發螺旋E與D向疏水內核的插膜運動，將動力分別傳給剪叉的兩臂螺旋A與B，引起像剪叉式升降機一樣的運動，迫使葉黃素分子和相鄰的葉綠素分子相互接近，從而實現葉綠素激發態的能量淬滅。從機械的角度，還能夠找到剪叉式升降機所對應的關鍵部件。類囊體腔側的螺旋E與D為一對頂槓，螺旋D端的殘基L206與螺旋B末端殘基V80、L84，螺旋E端的殘基W97與螺旋A的末端殘基F194、F195分別構成了類囊體腔側的兩個頂槓作用力支點。一對交叉排列的螺旋A和B為升降的兩個剪切臂，其交叉點處的鹽橋 (Arg70-Glu180，Glu65-Arg185) 為鉸點。温度升高或酸度增加時，螺旋E和D分別從跨膜螺旋A與B交叉面的內側將螺旋剪叉臂頂開，導致剪叉角度增加，帶動兩個剪叉式排列的葉黃素分子做相應的開叉運動，縮短了葉黃素分子與相鄰的葉綠素分子之間的距離，增強了色素之間的電子態耦合作用，提高了葉綠素激發態熒光淬滅的效率。尤其在低温條件下，位於腔側的穀氨酸 (E94) 與螺旋E近端的賴氨酸K99形成氫鍵，隨着温度的升高，螺旋E逐漸朝中心靠近，E94-K99之間的相互作用減弱，而E94與處於螺旋E 中段的谷酰胺Q103形成新的氫鍵，這説明E94協同參與了螺旋E的插膜過程。上述模型與已報道的分子生物學中單點突變的實驗結論相符合，如將E94突變成電中性甘氨酸，會導致非光學淬滅效率的降低。可見E94恰如開關中的觸臂，K99及Q103分別為兩個觸點，當E94與K99相觸的時候，系統處於高效捕光態，而當E94與Q103相觸的時候，則處於光保護狀態。
進一步從分子機器的角度可得出以下三個推論：
(1)插膜運動速率是能量淬滅過程的速率決定步驟，時間尺度為1.24 μs，因此光合系統能量耗散也應該在這個時間尺度。文獻表明，利用光聲光譜測定的活體葉片能量耗散時間為1.4 μs； (2)從機械的角度考慮，囊腔側螺旋插膜作用需要經過幾道環節的傳遞才能夠轉變為跨膜螺旋的剪叉升降運動，而傳遞過程中涉及的機械單元是典型的軟物質，因而光合膜剛度越大，力的傳遞效率越高，能量耗散的效果也就越好，這點也被文獻報道的實驗所證實。(3)能量淬滅態對應的是交叉跨膜螺旋對頂角更為張開的狀態，對應的光合膜變薄，這一點也與已報道的實驗觀測相符。
上述分子機制不僅與迄今為止的許多生物實驗觀測相符，還揭示了植物是如何應用穩態温度和瞬態温度來實現高效能量耗散、同時又可以避免蛋白質熱變性。一般情況下，當環境温度為25 ℃時，葉片的温度可達40 ℃。葉片對激發能的耗散弛豫時間為10 μs量級，進一步估算10 μs內吸收的光子數全部變成熱量可以引起LHCII三體瞬態温度上升14 ℃，並且該瞬態温度持續時間遠小於100 μs的蛋白質變性條件，因此不會引入額外的蛋白質變性，處於能量耗散光保護狀態的瞬態温度達到54 ℃，正好處於能量淬滅的最佳温度附近，而蛋白質的穩定性則由穩態温度40 ℃決定。可見自然界利用高瞬態温度實現最優化能量淬滅，同時維持較低的葉片穩態温度以保證蛋白質結構的完全可逆變化。
11 投稿——錘鐵成鋼的過程
一項經得起時間檢驗的研究工作的出爐，不但要感謝一路上相扶持的盟友，更要感謝那些曾經出手猛烈捶打的對手。原創性的工作通常會給探索者帶來按捺不住的驚喜，恨不得抓住每一個你認識或不認識的人，和他們傾訴你的發現，讓他們和你一起分享發現的喜悦。然而科學發現的分享和發表自有它的一套規則，即同行評審制度。出色的工作要經得住無比挑剔的審稿人的捶打，捶打的越猛，就如打鐵一樣，越能夠剔除雜質。然而該項制度設計理想的一面是這樣的，不理想的一面和其他行業一樣，折射出的是複雜的人性。當作者把論文投給影響因子高一些的雜誌時，第一關往往是兩週時間，內容和結果先要通過編輯部的預審，過了這一關才能到審稿專家手上。因此，大多數作者都會有詩中所描摹的新媳婦將要拜見公公婆婆的忐忑之心。不同的是，對於匿名審稿，多數情況下不知道審稿人是誰，以致習慣性地從評審意見的語氣、用詞和眼界去判斷審稿人的身份，論文中哪些觀點招惹了審稿人，甚至能夠讀出審稿人當時的心態，這種有點像狐狸和獵人之間鬥智鬥勇的過程對於初入此道的學生往往會感到迷茫，“翁老師，我們是做科學研究的，難道還要去分析審稿人的心情嗎？”不止一個學生向我提出這樣的困惑，而我的回答是“科學研究本身是客觀的，但科學是人做的，是由人來評判的”。
近試上張水部
朱慶餘
洞房昨夜停紅燭，待曉堂前拜舅姑。
妝罷低聲問夫婿，畫眉深淺入時無。
2017年12月底，收到第一次審稿意見。第一個審稿人的評價是“探索一個十分重要但很少被研究過的問題……總體來説這項工作給人印象深刻，大多時候表述得很好，反映了該領域的新進展”。第二審稿人在對工作給予一個簡潔的總結和建議之後，按照編輯部對稿件各方面的標準，逐一進行了回答，同時也列出了相應的問題，非常詳細和專業，説實在審稿人提出的一些生物學上的細節我們之前是沒有注意到的。按照以往的經驗，很快判斷出第一個審稿人是這領域的大家，也是我們學術思想的同盟軍。根據第二個審稿人如此多的細節問題，以及沒有讀出一種高屋建瓴的氣勢，我們判斷或許是某位大家手下的博士後。儘管意見很多，綜合起來還是很樂觀。
對於審稿人意見，尤其是貌似不友好的，習慣上都會放上一週等情緒平靜後再來比較客觀地逐一琢磨。這次也不例外，當讀到“ (葉綠素和β-胡蘿蔔素分子間) 激發態能量轉移效率最高處發生在多烯的骨架中心位置，而不是鏈端的六元環”時不禁出了一身冷汗：一個生物學的博士後絕對不可能有這樣的學識！一定是該領域的大家，而且猜測是對能量淬滅分子機制持反對觀點的一位歐洲科學院院士，這也預示着一場“惡戰”不可避免。
紅外光譜指認蛋白質籠統的二級結構一般不會招來質疑，如果要精確到空間的某一片段，往往需要其他手段的支持。蛋白質氨基酸序列單點突變技術是十分有效的方法，通過改變光譜指認片段的多肽序列，或者在結構上刪除該片段，如果對應的紅外光譜發生變化或消失，則為光譜指認提供了可靠的支持。我們先前和王志珍院士[10]、植物所種康院士[11]及昌增益教授[12]合作發表的工作都是以這樣的方式回答審稿人疑問的。這次審稿人同樣刺中了
在隨後第二、第三次回答中，雙方爭辯更加激烈，而第一個審稿人從此保持靜默，不給任何一句評價。在第三次給編輯的回信中，對於第二個審稿人的意見“基於上述通常的做法，我的結論是分子動力學模擬必須給出參與被研究調控過程的關鍵殘基或者結構域，然後對該殘基或者結構域進行突變來中斷調控過程，從而證實提出的假説”，高老師的回答也是充滿火藥味：“氨基酸殘基突變對某些問題固然有效，然而作為美國化學會旗下的期刊 Journal of Chemical Theroy and Computation 的編輯，可以肯定地説，這不是分子動力學模擬學術圈的標準，科學上對我們完全是不公正的”。這樣的交鋒結果可想而知，不僅拒稿，主編還直接告訴我們對該工作不再感興趣了。只好再改投另外的雜誌，我們的工作投過去不久，國外的一個工作跟蹤而至，利用基因敲除的方法，在一個結構類似的輔助捕光天線膜蛋白中證實了我們工作中理論預測的熒光淬滅色素對。結果是他們的工作發表了，我們的工作又被拒了，當然也收到了針對實驗幾乎點到死穴的審稿意見，即蛋白質變性温度和熒光淬滅温度問題，如果淬滅温度高於變性温度，則研究結果就偏離了實際情況，可以説是一劍封喉。經過幾個月的努力，終於從實驗和理論上解決了上述問題。回頭一看，國外在這一時期發出了十多篇論文，有的工作為了搶到優先權，從投稿到發表只用3天時間。從發表的論文中發現，原先審稿人拒絕我們的理由已經不復存在，我們把相關論文和申述意見寄給編輯部，主編居然受理了我們的申述，重新審稿。2020年春節，一個難忘的日子，收到了第四次也是最後一次該雜誌的拒稿信。儘管如此，還是對主編充滿感激之情。經過這幾輪捶打，終於明白一個道理，這個工作是難以在國外的高影響雜誌上發表的，最後決定投給《中國科學化學》。編輯部邀請了4位審稿人，又提出了一些很好的建議，修改稿終於於5月9日接收。在經歷了六輪的投稿，回答了上百個問題後，自以為到目前為止做的最為重要的一項工作，如一顆隨風飄浮的種子，終於落在自家的花園裏，衷心地祝願我國自己的雜誌越辦越好，打造一塊引吭高歌的發聲地。當把接收消息告訴高加力教授後，他給大家的回信是“這必將成為他們的領域的經典之作”，我把“他們的”改成了“我們的”。6月4號物理所學位評定委員會全票通過，授予在組裏工作和學習了8年之久的李昊同學博士學位。
12 結束語
對於科學探索，思想是自由的，而行動則會受到各種條件和規則的牽制，而從事自由探索的這個羣體，宛如一羣戴着腳鏈的舞者，在有限的空間中展現出無限的美麗。記得張殿琳院士有一次在物理所春季年度學術交流大會上就學術考核問題，引用了白居易的詩句：贈君一法決狐疑，不用鑽龜與祝蓍。
試玉要燒三日滿，辨材須待七年期。
周公恐懼流言日，王莽謙恭未篡時。
向使當初身便死，一生真偽復誰知？
張先生重點強調了“三日滿” 和“七年期”。對於崎嶇路上的探索者，也許這也是一種回答 (摘自汪國真《熱愛生命》)：
我不去想是否能夠成功
既然選擇了遠方
便只顧風雨兼程
然而現實是，只有成功，才有話語權。“publish or perish (要麼發表，要麼走人) ”流傳已不止一天了，天下苦秦久已！
參考文獻
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本文選自《物理》2020年第10期，經授權轉載自微信公眾號“中國物理學會期刊網”。