冷凍電鏡助力破譯大腦的分子密碼_風聞

大腦中有上千億個神經細胞，又叫神經元，它們之間通過百萬億個突觸聯結形成複雜有序的神經網絡與環路。神經網絡中高度有序的神經活動則構成了認知、思維、意識和語言等高級腦功能的基礎。就像通訊系統中，信息的收發和存儲依賴於通訊網絡的基站，神經信息的傳遞與存儲的最基本結構與功能單元則是神經突觸。

突觸功能的發揮則依賴於突觸中大量蛋白分子的協調工作，其中一種特殊的蛋白分子叫受體分子，也就是信息的接收器。當信息傳遞到突觸時，突觸前神經元就會釋放信號分子（神經遞質）到突觸間隙，突觸後神經元上的受體就會接受信號分子，使下一級神經元產生興奮或抑制。這些受體蛋白在突觸中的功能結構狀態以及它們在突觸中的數量和排列方式直接影響着大腦信息傳遞的效能。突觸又能夠根據神經活動的強弱而改變自身傳遞效能，亦即突觸可塑性，在這一過程中，突觸中的蛋白分子數量和分佈會發生變化，而記憶很可能恰恰就存儲於突觸中受體蛋白的組織和分佈變化中。

精確解析突觸的蛋白分子結構和組織架構、及其在神經活動或異常過程中的變化無疑是解密大腦奧妙的一個關鍵環節，也是腦科學與腦疾病研究中最基礎的核心研究方向之一。對大腦中各類受體蛋白為主的分子機器的作用機理進行解密，通俗講既是破譯大腦的分子密碼。

“眼見為實”，藉助成像手段直接透視生命體系中的物質組成與結構和內在規律，一直是生命科學研究的不二之法。神經突觸的大小在幾百納米的尺度（大概是頭髮絲直徑的百分之一）。突觸中的分子就更小了，通常在幾個納米左右。在這個尺度下，只有光學顯微鏡和電子顯微鏡能夠具備這種成像條件。光學顯微鏡由於光波長（200-600納米）的限制，仍舊沒有辦法觀測到突觸中的納米尺度的分子。電子顯微鏡所採用的電子波長經過加速後可達0.002納米，能夠觀察到高分辨的分子乃至原子信息。更進一步，冷凍電鏡技術使得我們可以直接觀察被快速冷凍固定（零下180°左右）在近生理狀態下的樣品。

冷凍電鏡（CryoEM）技術的快速發展，一方面使得眾多通過分離純化後的蛋白質等生物大分子近原子分辨三維結構得以解析，正因為如此2017年諾貝爾化學獎頒發給三位冷凍電鏡技術的開拓者。另一方面，基於最新的冷凍電鏡斷層三維成像技術（CryoET）能夠對保存在近生理狀態下細胞和組織樣本進行納米分辨率的三維成像，為在神經突觸及其它細胞區室中原位解析蛋白質分子結構和組織架構帶來了新的契機。

近日，中國科學技術大學與中國科學院深圳先進技術研究院雙聘教授畢國強和劉北明團隊，與美國加州大學洛杉磯分校周正洪教授合作，通過發展前沿冷凍電鏡細胞原位成像技術，首次解析了抑制性突觸中GABAA受體的原位三維結構，並首次闡釋了抑制性突觸中受體蛋白和骨架蛋白層級化的組織規則。研究成果以 Mesophasic organization of GABAA receptors in hippocampal inhibitory synapses為題發表在Nature Neuroscience上(DOI: 10.1038/s41593-020-00729-w).

在前期的工作中，研究人員將大鼠胎鼠的海馬體神經細胞解離並直接培養在冷凍電鏡的樣品載網上（類似於光學顯微鏡成像使用的載玻片），經過一段時間的培養後神經細胞之間能夠形成突觸連接，進而形成微型的神經網絡。這種樣品可以直接通過投入式快速冷凍固定，既是將電鏡載網直接投入到液氮冷卻的液態乙烷中，這樣在幾十毫秒內，神經細胞被冷凍固定到-180°以下，樣品內部近生理狀態下的結構細節得以保存，從而實現了對細胞的瞬間“定格”。這種樣品可以直接傳輸到冷凍電鏡中進行冷凍電鏡斷層三維成像（將樣品進行傾轉，同時收集不同角度的二維投影），經過後期三維重構處理，即可重現細胞內分子水平的三維結構細節，進而實現了對細胞超微結構的“回放”。

利用這種手段並結合自主研發的新型冷凍光電關聯顯微成像技術，研究人員開創性地對神經突觸超微結構與功能進行研究，解析了首個完整神經突觸的高精度三維結構，並實現了對中樞神經系統中兩類最主要突觸-興奮性與抑制性突觸的精確區分以及結構特徵的定量化分析(Tao, Liu et al. 2018a; Tao, Liu et al. 2018b; Liu, Tao et al. 2019; Sun, Liu et al. 2019)。

圖1. 冷凍電鏡斷層原位成像技術解析神經突觸受體蛋白原位結構與組織分佈

在此基礎上，研究團隊發展了一種基於過採樣與自動分類的冷凍電鏡斷層三維成像亞區域圖像處理方法，實現了對細胞斷層三維重構圖像中無標記和無模板依賴的蛋白質自動識別和三維重構分析。基於這一方法，研究團隊實現了對抑制性突觸中GABAA受體的自動化識別並解析了其19Å分辨率的原位三維結構，這是目前已報道的首個突觸原位受體蛋白結構。

進一步，通過對GABAA受體在突觸中的空間分佈進行分析，發現這些受體在抑制性突觸中呈現層級狀的組織分佈特性：GABAA受體之間可以形成具有距離固定（11nm間距）而相對角度可變的雙分子複合物；這種雙分子複合物進一步組成具有較低熵並且具備自組織特性的二維網絡；最後形成具有清晰邊界並介於固、液之間的“介態”相分離狀態（mesophasic organization）。這些組織形式可以通過突觸後支架蛋白和受體之間靈活的相互作用而形成，並且與突觸前囊泡釋放位點存在對應關係。

圖2. 抑制性突觸中受體等蛋白分子與細胞器組織分佈的三維可視化

(圖片版權：陶長路、劉雲濤、畢國強；圖片製作：王國燕、馬燕兵)

抑制性突觸中受體蛋白的這種半穩定的組織架構很好地體現了神經突觸既能保持信息傳遞穩定性又具備可塑性的結構基礎，從分子組織結構層面很好地解釋了學習與記憶的結構機理。通過應用與發展前沿細胞原位冷凍電鏡斷層成像技術這種全新的嘗試，實現了對突觸生理狀態下分子水平結構與功能探究的突破，為破解大腦的分子密碼邁出了關鍵的一步。

參考文獻：

1. Tao, C. L., et al. (2018). “Differentiation and Characterization of Excitatory and Inhibitory Synapses by Cryo-electron Tomography and Correlative Microscopy.” JNeurosci 38(6): 1493-1510.

2. Tao, C. L., et al. (2018). “Accumulation of Dense Core Vesicles in Hippocampal Synapses Following Chronic Inactivity.” Front Neuroanat 12: 48.

3. Liu, Y. T., et al. (2019). “Postsynaptic protein organization revealed by electron microscopy.” Curr Opin Struct Biol 54: 152-160.

4. Sun, R., et al. (2019). “An efficient protocol of cryo-correlative light and electron microscopy for the study of neuronal synapses.” Biophysics Reports 5(3): 111-122.

作者：劉雲濤、陶長路、畢國強

來源：中國科學技術大學