醫學突破的先鋒-CRISPR介導的HeLa細胞基因編輯 | 源井生物_風聞

1952年，Henrietta Lack（HeLa）細胞成為第一個可以在實驗室中無限傳代的人類細胞系，而這些細胞被科學家們標記為“永生的”。**研究人員最初是從侵襲性宮頸癌腫瘤中提取出的HeLa細胞。**這些細胞在不斷供應的營養物質下持續繁殖，並在不到24小時內生產出新一代的細胞。與許多腫瘤一樣，Hela細胞具有錯誤組成的基因組，其中多個染色體有一個或多個拷貝：**正常細胞有46條染色體，而Hela細胞包含76至80條染色體，其中一些染色體嚴重突變。**同時，這些細胞還表達了過反應性端粒酶，即每次分裂後重建端粒，防止細胞衰老，以允許HeLa細胞無限傳代。

**HeLa細胞係為許多醫學突破都做出了貢獻，從研究太空零重力效應和脊髓灰質炎疫苗的開發，到白血病、艾滋病病毒和癌症的全球性研究。**儘管現在有許多其他細胞系也在使用，但自HeLa細胞被分離以來，HeLa細胞在當今醫學研究的大多數領域都取得了一定的進展，尤其是在癌症生物學，傳染病，基礎微生物學等領域都取得了一些重大進展。**涉及HeLa細胞的研究已經在超過11000份科學刊物中描述過，其中包括三份獲得過諾貝爾獎的：**2008年發現人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌的致病因子；2009年發現端粒酶可以保護染色體的端粒，從而防止染色體的降解，和2014年促進在細胞生長方面的實時觀察。這個驚人的數字清晰地表明這些細胞在過去六十年中對研究的重要性。

HeLa細胞的多功能性和強大功能使其成為必不可少的實驗室工具，繼續為人類健康與疾病的基礎提供新的線索。HeLa細胞是熱門的細胞模型之一，也是生命科學家的工具，去研究疾病或治療活性藥物分子的作用機制，以及破譯細胞信號的傳導，如DNA損傷修復。**研究人員選擇HeLa細胞作為多學科研究的工具，因為它具有永生的細胞特徵，可適用於多組學數據庫（基因組學，蛋白質組學，和轉錄組學），並且易於利用這些數據庫來設計和改進研究項目。**最近的一項研究就是利用HeLa細胞研究SARS-CoV-2病毒在人體中的感染性。**研究COVD-19的科學家們使用HeLa細胞以確定病毒用於進入人體細胞的受體。**基於對HeLa細胞的研究，新型冠狀病毒的研究取得了前所未有的進展。

應用範圍：

HeLa細胞已經發展成為研究各種課題的有用模型。源自HPV轉化的宮頸腺癌細胞的HeLa細胞已被用於各種研究，包括但不限於癌症的研究。作為一種腫瘤模型，它們已被廣泛應用於研究中：

1. 腫瘤細胞的遷移和侵襲

2. 藥物開發

3. 細胞死亡途徑

CRISPR-U™ 基因編輯在HeLa細胞的應用

CRISPRCRISPR-Cas系統已經成為了革命性的基因組編輯工具，為生命科學的發展和我們對生命的理解提供了巨大的動力。CRISPR系統用於精確的基因組編輯，可以通過用所需的供體序列取代靶基因序列來進行基因敲除或敲入基因組的操作。

HeLa細胞是一種侵襲性宮頸癌細胞系。在HeLa細胞系中進行基因編輯可以產生單個或多個基因敲除，正確的突變或插入報告基因轉基因。這些經過基因組編輯的HeLa細胞系將提供給研究人員用於研究癌症，癌症治療，細胞死亡，功能基因組學，信號通路，藥物研發，藥物反應和細胞治療。

圖：針對工程ESC和iPSC的CRISPR-U™定製流程 源井生物自主研發的CRISPR-U™可用於HeLa細胞系的基因操作。因此，利用CRISPR/Cas9系統可以在HeLa細胞中實現基因組編輯。源井生物可以定製真核HeLa細胞中的基因編輯，也可以在動物模型中進行各種基因改造。

源井生物自主研發的 CRISPR-U™ 技術優化了真核細胞和動物基因編輯載體和過程。效率和準確度比傳統方法提高了10倍。馬上聯繫我們，瞭解與您研究相關的服務吧！

基因敲除Hela的研究案例：

CRISPR/Cas9介導的TERT的紊亂可抑制腫瘤細胞的存活

端粒是真核細胞中維持染色體完整性的一種獨特結構。**哺乳動物的端粒長度主要受端粒酶的調控，而端粒酶是一種核糖核蛋白，由逆轉錄酶（TERT）和RNA亞基（TERC）組成。**TERC在所有細胞中都有組成性表達，而TERT的表達則是在大多數成年體細胞中受到時間和空間上的調控。在體細胞中，TERT被滅活，因此端粒酶活性不會被檢測到。**而大多數腫瘤細胞通過激活TERT的機制來阻止進行性端粒侵蝕以實現增殖永生。**因此，TERT失活被認為是一種很有前景的腫瘤治療手段，研究人員利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯系統來靶向癌細胞中的TERT基因。為此，他們選擇了三種不同的癌細胞系：宮頸癌細胞系（HeLa）、胰腺癌細胞系（PANC1）和乳腺癌細胞系（SUM159），並設計了三個分別針對人類TERT基因外顯子2（E2）、外顯子4（E4）和外顯子6（E6）的gRNAs（sg1、sg2和sg3）。研究人員進一步設計了另外兩個靶向TERT外顯子4（E4）側翼內含子的gRNAs（sg4和sg5）來產生KO-TERT細胞。在單倍劑量不足的研究中，突變的TERT細胞端粒酶活性降低，端粒變短。**與WTPE-Hela細胞相比，細胞增值測量、細胞培養密度和更強的β-gal染色信號都顯示出突變的TERT細胞產生了嚴重的細胞衰老。**Annexin V和PI染色也提供了細胞凋亡的證據：突變的TERT細胞比WTPE-Hela細胞具有更高的凋亡率；在體外腫瘤細胞中缺乏TERT單鏈則導致細胞的生長遲緩和加速死亡。

圖1：Tert+/-癌細胞生長遲緩，細胞加速死亡。（A） WT和TERT+/-Hela細胞的羣體倍增時間。（B） 第2代（P2）、P5和P7代WT和TERT+/-Hela細胞的光學顯微鏡圖像。（C）WT和TERT+/-Hela細胞的β-gal染色。箭頭指示嚴重衰老細胞的例子。（D）LDH法測定WT和TERT+/-Hela細胞的細胞死亡率。（E）流式細胞術定量分析annexin-V和碘化丙啶（PI）染色對WT和TERT+/-Hela細胞中的細胞凋亡現象。**p<0.01。

研究人員進一步利用腫瘤異種移植的裸鼠模型研究了TERT單倍劑量不足對腫瘤細胞的存活率的影響，並在接種後6周檢查異種移植物的大小。正如預期，WTPE-Hela細胞在動物體內生長成直徑約2cm的腫瘤塊，而TERT突變的Hela細胞在動物體內未能形成任何的腫瘤塊，這一結果證明了Cas9介導的TERT單倍劑量不足可以有效地抑制腫瘤細胞的生長。

圖2：WT和TERT+/-Hela細胞在裸鼠體內的異種移植**基因點突變Hela的研究案例：**利用CRISPR/Cas9引入致病性MSH2點突變導致人類細胞差異性基因組的失穩

**重複去穩定化與人類疾病有多種關聯，特別是在腫瘤性疾病中。微衞星不穩定性（MSI）被認為是簡單反映了DNA錯配修復（MMR）缺陷。**而MSI+表型在各種人類腫瘤中並不相同。根據微衞星變化的頻率，MSI分為MSI-H（高）和MSI-L（低）。此外，MSI還對其不同的定性模式進行了分類，如A型和B型。早前的一項研究表明，MMR基因敲除小鼠中的腫瘤並未表現出MSI-H腫瘤中典型的劇烈微衞星變化（即B型），而是小而細微的改變（即A型）。

**林奇綜合徵（LS）被稱為遺傳性非息肉性結直腸癌（HNPCC），是遺傳性結直腸癌（結腸癌）的最常見原因。MLHL，MSH2，MSH6，PMS2和EPCAM這些基因的突變是造成林奇綜合徵的因素。**在這項研究中，利用CRISPR/Cas9系統將林奇綜合徵（LS）中的MSH2突變引入到HeLa細胞中。研究人員使用基因組編輯載體pSpCas9（BB）-2A-Puro（pX459），gRNA（由CRISPR-direct和CRISPR設計工具設計）並使用BbsI位點亞克隆到pX459中。使用Lipofectamine

2000將編碼gRNA的pX459質粒和三種不同的單鏈ssODN共同轉染到細胞中。產生的突變克隆清楚地表現出具有烷化劑耐受性和突變頻率升高的MMR缺陷表型。然而，微衞星並沒有像MSI-H腫瘤在林奇綜合徵患者中表現得那麼顯著地不穩定，且所有觀察到的變化均為A型，而這恰恰證實了小鼠的結果。這些發現表明人類基因組中重複不穩定的分子機制是更加複雜的。

圖：CRISPR/Cas9系統將MSH2 G674突變引入HeLa細胞。（A） 人MSH2蛋白中的功能區域，包括Walker A基序，（B）每個G674突變體版本中Walker A基序中的局部DNA和氨基酸序列，（C）用於實驗的嚮導RNA和ssODN的結構。（D）Sanger方法確認每個已建立的HeLa克隆。

這項研究已成功獲取了MSH2突變的HeLa克隆，並且這些已建立的克隆明顯表現出具有烷化劑耐受性和升高的突變頻率的MMR缺陷表型。儘管在這些克隆中，微衞星並未像林奇綜合徵患者中的腫瘤那樣表現出明顯不穩定。目前的發現表明，除了MMR缺陷外，以前無法識別出的分子機制可能是人類細胞重複失穩的根本。

**基因敲入Hela的研究案例：**sgRNA的可逆遮蓋/揭開策略（Cloaking/Uncloaking strategy）可控制CRISPR–Cas9在體外和活細胞中的基因編輯效率

**RNA“遮蓋”（RNA Cloaking）是控制RNA雜交，摺疊和酶促相互作用的温和且可逆的一種化學方法。**在這項研究中，研究人員使用疊氮化物取代的酰基咪唑試劑（NAI-N3）在合成後酰化RNA的20-OH基團，導致RNA摺疊，雜交和功能的阻斷。使用水溶性磷化氫處理後，此類聚酰化（“遮蓋”）RNA的體外活性可被有效修復，這種水溶性磷化氫引起疊氮化物的施陶丁格還原反應，然後自發地失去酰基（“揭開”）。研究人員用sgRNAs研究這些可逆的遮蓋/揭開現象，來調控CRISPR-Cas9系統在體外和活細胞中的基因編輯效率。

對於體外研究，研究人員設計了一種體外基因編輯模型平台，該平台具有103個核苷酸長（nt）的合成sgRNA，是以Cy5標記的雙鏈DNA（dsDNA）為靶點並編碼一部分的綠色熒光蛋白（GFP）。他們發現，當被“遮蓋”的sgRNA與三羥丙基膦（THPP）或二苯基膦苯-3-磺酸鹽（TPPMS）在濃度為1-5

mM的磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）緩衝液中於37℃培養1小時時，得到了最高程度的Cas9介導的DNA切割——表現為在定量層面上活性被完全恢復到未處理sgRNA的水平。這種驚人的體外表現表明了該方法在CRISPR-Cas9診斷應用中的控制時機和啓動方面是有潛在用途的。

對於體內研究，研究人員使用了GFP陽性的HeLa細胞，而這些細胞最初是通過核轉染或商用陽離子脂質轉染GFP靶向sgRNA和Cas9蛋白。他們進行了一項實驗，基於與體外實驗相同的步驟，用來測試“遮蓋”由CART遞送的GFP靶向sgRNA是否能夠阻斷在GFP陽性HeLa細胞中CRISPR–Cas9的基因組編輯。他們觀察到用“遮蓋”的sgRNA/Cas9

mRNA轉染的GFP陽性細胞與未處理的細胞有着相同的GFP熒光表達水平。這證實了sgRNA的酰化基本上阻斷了活細胞中的所有sgRNA的活性。因此，該研究強調了可逆RNA酰化可作為一種新的方法來控制基因組編輯的功能。

圖1：（a）NAI-N3抑制CRISPR-Cas9基因編輯的機制。sgRNA的“遮蓋”是通過Cas9核酸酶抑制RNA引導的DNA雙鏈切割（b）使用Cy5標記的dsDNA和未處理的，“遮蓋”的和“揭開、未遮蓋”的（磷化氫處理的）sgRNA在體外的Cas9核酸酶測定的PAGE分析。（c）條形圖表示gRNA與Cas9s培養後的DNA裂解分數。

圖2：磷化氫控制人類細胞中被“遮蓋”的CRISPR–Cas9活性。（a）

GFP陽性HeLa細胞的流式細胞儀分析顯示，被“遮蓋”的sgRNA活性喪失，並通過磷化氫處理修復編輯；（b）圖表（數據來自流式細胞儀）顯示未處理的，“遮蓋”的和磷化氫處理的sgRNA的基因編輯效率（c）熒光顯微鏡圖像顯示用未處理的sgRNA和Cas9

mRNA轉染後的GFP敲除，被“遮蓋”的sgRNA失去編輯的作用，使GFP熒光不受影響，以及用磷化氫處理後細胞的編輯作用恢復。

參考文獻**:**

CRISPR/Cas9-Mediated

TERT Disruption in Cancer Cells. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 653.

Differential genomic de-stabilization in human cells with pathogenic

MSH2 mutations introduced by genome editing. Experimental Cell Research,

2019 (377) 24–35.

Reversible RNA acylation for control of CRISPR-Cas9 gene editing. Chem. Sci.,

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