實驗室“迷你版”達爾文進化——定向進化_風聞

從恐龍時代到人類現代文明，自然界生命萬物無時無刻不在進化發展、繁衍生息。生物進化的基本環節可概括為：突變、選擇（海選/選撥）、隔離（優秀選手單獨培養）、優良性狀的脱穎而出或物種形成。在這個過程中，隨機的基因突變一旦發生，就受到自然選擇的作用，但是新性狀特徵的穩定或物種的形成則可能需要上萬年時間的演化。

隨着科學的進步和基因工程技術的不斷發展，科學家們不禁設想：是不是可以在實驗室創造出各種可能的基因突變組合，來模擬和加速自然進化和篩選的過程？按需設計，對症篩選，快速得到我們想要的功能為人類造福呢？

帶着這種思考，美國加州理工大學的Frances H. Arnold教授率先將這種想法付諸於實施，用於生物酶的定向進化（Directed evolution），並在綠色化工、生物能源、醫藥等領域取得了一系列開創性成果。她本人也因此獲得2018年諾貝爾化學獎。下面我們就來看看這項革新性技術是怎麼運作，以及它對人類生產生活做出了哪些美好貢獻吧！

圖1 自然進化到實驗室定向進化（圖片來源：諾貝爾獎委員會（左）；FH Arnold, 2018 (右)）

如何實現生命載體——蛋白質的定向進化

蛋白質是生命活動的執行者。酶（enzyme）也是一種蛋白質，是生物體內的高效催化劑，生命體進化了形形色色、功能各異的酶和蛋白質催化細胞內各種化學反應和新陳代謝過程（如食物的消化，毒物的分解，養分的合成，植物的光合作用等）。這些反應和功能幫助細胞更好的適應其特定的生存環境，也可被聰明的人類利用來生產各類化學品、抗生素和藥物等，減少化學合成法的環境污染問題。

然而生物體內天然酶的任務僅為滿足自身生命活動所需，無需提優或額外作業，人類若要利用它們進行生產和工業製造，就要改造它們，把它們訓練成各行各業的精英甚至身懷絕技的特種兵。定向進化則可以説是打造這種精英速成班或特種兵訓練營的工具。

前面提到，自然進化的關鍵是突變和篩選。同樣，實驗室定向進化也是以這兩項技術為基礎來運作實現的。定向進化是一個迭代重複的過程，包括：初始目標蛋白的選定、基因的突變（多樣化）、高效蛋白表達和篩選策略的制定和運行，然後對篩到的優良突變體基因進行再次的突變和篩選。多次循環，優中拔優，直到獲得滿意的性能，如：提高的酶活性，提高的抗體結合力，酶底物特異性的改變，甚至創造全新的反應類型等。

圖2 酶定向進化技術流程圖（圖片來源：諾貝爾獎委員會，作者整理）

那麼，如何對一個（目標蛋白或酶的）基因進行突變，構建一個包含它各種可能突變體的基因文庫呢？這對科學家們來説已經是“小菜一碟”了，現代分子生物學和基因工程技術的發展已促生了許多成熟可靠的基因突變文庫構建方法，基本1-3天就可以完成突變文庫的構建。

圖3是一些常見的突變體文庫構建方法，1) 易錯PCR：即故意在DNA擴增時隨機引入錯配，以獲得該基因的各種突變形式，構建隨機突變文庫。2）DNA“洗牌”（DNA Shuffling）：將兩個以上序列和功能相近但來自不同物種的同源基因（相似度至少>50%）隨機切成小片段（如：25-100 bp），不同小片段之間互相交錯疊搭，重新組裝，形成全新的多種雜合形式的完整基因片段（Stemmer, 1994），這屬於同源重組法，可快速將各個有益突變進行組合，就如同集父母優點於一身的孩子。3）對一些已知結構的蛋白來説，科學家們還可以有針對性的選擇那些與功能發揮最相關的氨基酸，將它們突變為其他氨基酸，建立”小而精”的基因突變文庫達到快速優化酶催化性能的目的（這也叫酶的半理性設計），德國馬普煤炭研究所的Manfred T. Reetz教授是這方面的領軍人物。4）隨着對酶分子蛋白序列-結構-功能關係認識的深入，以及計算生物學的發展，科學家們也開始利用計算機來模擬突變，通過一系列生物信息學算法快速準確的預測各突變體的穩定性、活性和底物結合特性等，從而有選擇性的去建庫表達和篩選，將繁重的文庫遴選工作交給計算機進行，縮小了人工篩選的範圍。儘管這方面對計算的依賴性很大，目前成功率還不是很高，但相信計算機虛擬定向進化（in silico-directed evolution）將會是未來發展的一個重要方向。

圖3 幾種基因突變文庫的構建方法 

蛋白表達和篩選：數以萬計甚至億計容量的基因突變文庫建立後，首先要進入細胞表達成為功能蛋白才能進行篩選和驗證。常用的表達宿主有大腸桿菌，酵母和枯草芽孢桿菌等。進入宿主後，含每個突變體選手的細胞各自分離，八仙過海各顯神通（功能）。這時，面對海量的突變體選手，簡便快速高效的篩選方法就像是能夠有效識別千里馬的伯樂，是定向進化能否成功的關鍵。

高通量的篩選方法一般通過濁度、顏色、熒光或化學發光等光學特性達到快速評估的目的。比如：根據酪蛋白平板上形成透明水解圈的大小來判斷蛋白水解酶活性的高低；利用酶底物或產物自身或與特定試劑反應後能呈顯顏色或激發熒光的特性，根據顏色或熒光的強弱判斷酶活性的高低；根據所攜帶熒光報告因子的發光強弱將含突變體的細胞進行分揀篩選；甚至還可將每個突變體的催化反應包裹在微小液滴中，當液體流過熒光分揀儀時將不同突變選手優勝劣汰。

這些方法的篩選量可達104-109（如微液滴法）個突變體，我們可以根據不同需要來量身定製。當然，也並不是所有的化學反應都能夠找到快速高效的篩選方法，因此，針對不同蛋白、不同的功能和特性，科學家們還在努力不斷開發出更多、更先進的篩選方法。這樣，經過幾輪的定向進化淘選，初試和複試，出類拔萃的選手就會脱穎而出。

圖4 常用定向進化文庫篩選方法（圖片來源：Packer & Liu，2015。作者整理）

定向進化技術的應用——對人類生產生活的貢獻

定向進化自發展以來廣泛應用於基礎科研、綠色化工和製藥行業。不僅用於提升酶已知的催化特性，以更加綠色環保的方式來生產塑料、農藥、燃料等；還賦予酶催化自然界從未有過的化學反應的能力，使其在工業上具有更廣泛的應用潛力。如：

提高酶在特殊環境下的穩定性和活性：1993年，定向進化技術開創者Arnold教授，對枯草桿菌蛋白酶E進行多輪易錯PCR隨機突變，使其在有機溶劑DMF中穩定性增強，活性提高了256倍。就如同給該酶披了件鐵布衫使其在惡劣的有機工業環境中仍能孜孜不倦的工作，大大提高了其合成藥用高分子化合物多聚-L-甲硫氨酸的能力。

改變酶的底物或產物範圍：類胡蘿蔔素具有抗氧化活性，在抗腫瘤或慢性疾病治療方面具有潛在的應用價值。Arnold團隊對類胡蘿蔔素合成途徑進行定向進化，利用DNA洗牌術改造八氫番茄紅素去飽和酶，首次在大腸桿菌中合成新型非天然類胡蘿蔔素化合物。2018年Pawlowski等改造大環內酯激酶的底物特異性，成功合成新型抗生素前體。2011年Bastian等改造異丁醇生物合成途徑中的酶，使異丁醇以100%的理論產率合成，用於工業大規模生產異丁醇生物燃料。

改變酶的對映體選擇性：Arnold團隊通過反轉海因酶的對映體選擇性來合成L-甲硫氨酸，Pavlidis等通過改造轉氨酶的活性和立體選擇性合成手性胺等，均對工業生產和製藥行業具有重要意義。

抗體的定向進化：定向進化在抗體親和力改造和抗體藥物篩選方面也取得了很大成功。如2002年FDA批准上市用於治療類風濕性關節炎的阿達木抗體即是利用進化篩選來的人源化抗體，徹底解決了異源抗體的免疫排斥問題。

催化新的化學反應：2016年Ellefson等曾通過定向進化賦予了逆轉錄酶幾十億年來所沒有校對糾錯功能。Arnold等對P450酶的改造賦予了該類酶一系列催化全新反應的能力，如：雜環烯烴的卡賓反應，反馬氏烯烴氧化反應和不對稱合成烯丙胺的反應等，在生物燃料、化工合成和醫藥領域具有廣闊的應用前景。

最引人注目的是“女神”Arnold團隊2016年改造細胞色素C氧化酶，使其具備了前所未有的“碳-硅”鍵形成能力，將硅元素引入生命有機體。該重大發現除了可以更經濟環保的方式生產有機硅化合物，應用於製藥、半導體等行業，還一度引起不少人驚呼構建“硅基生命”的可能性。

圖5 細胞色素c突變體的血紅素蛋白在大腸桿菌細胞內催化碳-硅 (C-Si) 鍵形成，室温高效合成有機硅化合物（圖片來源：Kan et al, Science，作者整理）

目前地球上發現的生命有機體皆是以碳元素為基礎的碳基生命，那些出現在科幻小説和電影中的地外生命形式有朝一日會出現在我們的生活中嗎？硅基生命真的可能存在嗎？或許我們對地外生命形式的認識正在拉近，這些問題將會由未來的科學家們去探索、發現和創造。

酶和蛋白質的定向進化現已成為生物工程領域的“硬核”技術手段，不僅加深了我們對蛋白質結構-功能關係的認識，也為人類生活帶來了福祉。它不僅可以針對某一蛋白進行改造，還可以改善細胞代謝途徑、優化代謝網絡、獲得期望表型的細胞，是將來合成生物學開發更多、更精確的功能元件，設計組裝新生物系統強有力的工具。正如Arnold所説“我們在教酶如何進化的同時，自身也在不斷學習進步”。

參考文獻:

1. FH Arnold. Directed Evolution: Bringing New Chemistry to Life. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 4143 – 4148

2. 曲戈，張錕，蔣迎迎，孫周通，2018諾貝爾化學獎：酶定向進化與噬菌體展示技術，生物學雜誌，2019，36（1）：1-6

3. RE Cobb, R Chao, H Zhao. Directed evolution: Past, present, and future. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 59, 1432–1440.

4. MS Packer, DR Liu. Methods for the directed evolution of proteins. Nature Reviews Genetics. 2015, 16, 379–394.

5. C Schmidt-Dannert, D Umeno, FH Arnold. Molecular breeding of carotenoid biosynthetic pathways. Nature biotechnology. 2000, 18(7): 750-753

6. SBJ Kan, RD Lewis, K Chen, FH Arnold. Directed evolution of cytochrome c for carbon–silicon bond formation:Bringing silicon to life. Sicence. 2016, 354: 1048-1051

7. F Ma, MT Chung, Y Yao, R Nidetz, LM Lee, AP Liu, YF, K Kurabayashi & GY Yang. Efficient molecular evolution to generate enantioselective enzymes using a dual-channel microfluidic droplet screening platform. Nature Communications. 2018, 9: 1030

8. JW Ellefson, J Gollihar, R Shroff, H Shivram, VR Iyer, AD Ellington. Synthetic evolutionary origin of a proofreading reverse transcriptase. Science, 2016; 352 (6293): 1590-1593

來源：中國科學院青島生物能源與過程研究所