新研究：新冠患者病毒存在快速進化風險，需更多序列追蹤進化

澎湃新聞3月8日報道，新冠病毒的進化速度、病毒與被感染者肺中其他微生物互動的方式，目前尚不清楚。近日，國際學術期刊《臨牀傳染病》（Clinical Infectious Diseases）刊發了來自中國研究團隊的學術論文：新冠病毒在患者體內的基因多樣性（Genomic diversity of SARS-CoV-2 in Coronavirus Disease 2019 patients），聚焦了以上問題。

研究團隊對8例新冠肺炎患者，25例社區獲得性肺炎（CAP，指在醫院外罹患的肺實質炎症）患者和20例健康對照者的支氣管肺泡灌洗液進行了轉錄組測序。研究得出在一些新冠病毒感染者體內發現了病毒多樣性水平升高，這表明病毒存在快速進化的風險。儘管沒有發現宿主內變異（intra-host variants）傳播的證據，但也不應忽視這種風險。

研究團隊還表示：病毒在感染患者後會在其體內進化，這可能會影響病毒的毒力、傳染性和可傳播性。儘管宿主內變異如何在人羣中傳播尚不清楚，但有必要加強對人羣中病毒進化和相關臨牀變化的監測。

值得注意的是，患者新冠病毒基因組可能高度多樣化，這在其他病毒中也能觀察到。高多樣性可能會增加病毒種羣的適應性，使其難以消除。需要進行進一步的研究，以探索這可能如何影響對病毒的免疫反應，以及在人體或在傳播過程中是否存在對不同毒株起作用的選擇。

研究最後總結道，總的來説，這項研究揭示了患者體內新冠病毒的進化，這是大多數RNA病毒的共同特徵。這些變異如何影響病毒的適應度和羣體的遺傳多樣性，有待進一步的研究。目前，公共數據庫只共享有限的序列，因此迫切需要積累更多的序列來跟蹤病毒基因組的進化，並將這些變化與臨牀症狀和結果聯繫起來。

該論文團隊成員來自以下單位：中國科學院北京基因組研究所；中國科學院大學；國家衞健委重點實驗室，中國醫學科學院病原生物學研究所；北京大學生物醫學前沿創新中心；北京大學人民醫院呼吸與危重症醫學科；廣東省新發傳染病診治重點實驗室，新發傳染國家重點實驗室；福建人民醫院；西安交通大學第一附屬醫院；中國科學院動物進化與遺傳前沿交叉卓越創新中心等。論文的通訊作者為中國科學院北京基因組研究所研究員、博士生導師李明錕。

新冠病毒感染者體內高水平的宿主內變異

根據目前的數據，估計早期的新冠病毒基本傳染數（R0）在2.2到3.5之間，對公共健康構成了嚴重威脅。最近的研究已將蝙蝠確定為新冠病毒的可能來源，該病毒可能使用與SARS-CoV相同的細胞表面受體，即ACE2。這些研究提高了我們對新冠病毒的理解。但是，我們對新型病毒的瞭解仍然有限。

在人體中，新冠病毒得承受強大的免疫壓力，這可能令病毒不斷積累突變，從而突破免疫系統的控制。這些突變可能導致新冠病毒的毒力、傳染性和傳播性發生變化。因此，研究者們認為必須研究突變的模式和發生的頻率。

研究團隊對8名患有新冠病毒感染者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）樣本進行了轉錄組測序。2019年12月24日至2020年2月9日之間收集的這110個序列研究發現，宿主內變異的數量在0到51之間，中位數為4，表明該病毒的進化速率很高。

研究團隊總共鑑定出84個宿主內變異，其最小等位基因頻率（MAF，通常是指在給定人羣中的不常見的等位基因發生頻率）大於5％，而25個變異的MAF大於20％。

值得注意的是，變異的數量與測序深度無關。

總體Ka/Ks（異義替換（Ka）和同義替換（Ks）之間的比例，可以判斷是否有選擇壓力作用於這個蛋白質編碼基因）明顯小於1，這對於宿主內變異和羣體數據中觀察到的多態性而言是相似的，這表明：純化選擇作用於兩種類型的突變。

在基因中觀察到的變體數目與基因長度成比例（對於宿主內變異，cor＝0.950，p＝8E-06；對於多態性，cor＝0.957，p＝4E-06）。儘管在多位患者中僅觀察到一小部分變異（圖2C，84位患者中的2位），但某些位置更容易發生突變，例如位置10779，在所有7位患者中均觀察到了突變等位基因A，頻率範圍從15％到100％。

每個個體的宿主內變異數量顯示出較大的差異（MAF≥5％的變異為0到51，中位數為4； MAF≥20％的變異為0到19，中位數為1），這不能用批次效應、覆蓋範圍差異或污染（新冠病毒感染者一至四即nCoV1-4在一批中，新冠病毒感染者五至八即nCoV5-8在另一批中；大多數突變未在羣體數據中觀察到）來解釋。研究團隊還注意到，變異的數量與症狀發作後的天數或患者的年齡無關。

總體而言，沒有找到導致新冠病毒感染者六中有極高水平變體的任何原因（51個變體）。

研究團隊表示，需要更大的人羣規模來研究此類異常值的頻率以及它們與宿主免疫反應水平或病毒複製率是否相關。研究人員還注意到其他病毒的異常值。值得注意的是，變異的來源可能是感染後體內發生的突變，也可能是多重傳播的新冠病毒株。

研究團隊在討論環節提到，RNA病毒具有很高的突變率。因此，RNA病毒容易產生對藥物的抗性並逃避免疫監視。新冠病毒的突變率仍不清楚。但是，這項研究得出新冠病毒的突變率應與SARS-CoV處於相同的數量級。高突變率還導致RNA病毒中高水平的宿主內變異。對於頻率≥5％的變異體，新冠肺炎患者的宿主內變異體的中位數為4，該發生率與埃博拉病毒病研究中報道的發生率無明顯差異（134個樣本中頻率≥5％的655個變異體，p> 0.05），這表明新冠病毒的突變率也與埃博拉病毒相當。

另外，此前的研究提出一種核糖核酸外切酶（ExoN）可以在SARS-CoV中提供校正活性，並且注意到該基因中的所有三個關鍵基序在SARS-CoV和新冠病毒之間是相同的。此外，在這些基序中均未檢測到多態性或宿主內變異，表明該基因是高度保守的，因此它可能是抗病毒治療的潛在靶標。

研究團隊指出，儘管在多態性或宿主內變異中均未發現任何突變熱點基因（突變幾率較高的鹼基序列），但觀察到不同個體之間共有宿主內變異，這暗示着病毒在患者體內適應性進化的可能性，這可能會影響其抗原性、毒力和病毒的傳染性。

值得注意的是，患者新冠病毒基因組可能高度多樣化，這在其他病毒中也能觀察到。高多樣性可能會增加病毒種羣的適應性，使其難以消除。需要進行進一步的研究，以探索這可能如何影響對病毒的免疫反應，以及在人體或在傳播過程中是否存在對不同毒株起作用的選擇。

沒有證據表明樣品之間宿主內部變異的傳播

在八名新冠病毒感染者中，感染者四（nCoV4）和感染者七（nCoV7）來自同一家庭，症狀發作的日期相差五天。高度懷疑病毒由感染者四傳染給感染者七，特別是考慮到只有感染者四曾進入武漢華南海產品市場，這是疫情暴發的起點，並被懷疑是新冠病毒的起源。

首先，對於兩個樣品，病毒的共有序列相同，所有四個通過感染者四選擇標準的宿主內變異在感染者七中都沒有檢測到。研究者進一步將研究範圍擴大到MAF≥2％的所有變異，並得到至少3個讀段的支持。通過這樣做，研究者檢測到兩個樣本之間共有7個變異（共25個）。

但是，感染者四和感染者七中的MAF與其他樣品中的MAF相似，這表明這些位置要麼容易出錯，要麼容易突變。因此它們不能支持這些變異的傳播。

同時，在所有84個宿主內部變異中，只有3個在種羣數據中是多態的（位置7866 G / T；27493 C / T；28253 C / T）。這種少量的重疊也表明宿主內變異很少傳播給其他樣品。但是，不能排除當前數據庫低估了種羣中序列多樣性的可能性。

研究團隊在討論中還提到，在本研究的單個傳播事件中，研究團隊沒有發現多種毒株傳播的證據。然而，尚不清楚這些宿主內變異是發生在傳播之前還是傳播之後，這也會產生不同的結論。此外，傳播可能會遇到瓶頸，這也可能導致多樣性的喪失。

沒有發現新冠患者中有任何特定的微生物羣模式

除病原體外，肺部的其他微生物羣，也與疾病的易感性和嚴重性有關。肺微生物羣的改變可能會改變針對病毒和繼發性細菌感染的免疫反應。因此，瞭解包括可能引起繼發感染或對黏膜免疫系統產生影響的細菌的微生物羣，可能有助於預測並減少併發症。

黏膜免疫系統，指廣泛分佈於呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道粘膜下及一些外分泌腺體處的淋巴組織，是執行局部特異性免疫功能的主要場所。

總體來説，新冠病毒感染者、社區獲得性肺炎患者和健康組之間的微生物羣組成存在顯着差異（R2=0.07，p=0.001）。

但是，某些新冠病毒感染者的樣本聚類分析表明：某些樣品的微生物羣比較貧乏。除去有問題的樣本後，研究仍然發現新冠病毒感染者和社區獲得性肺炎患者均與健康對照組不同（新冠病毒感染者與健康組：R2=0.45，p =0.001；社區獲得性肺炎患者與健康組：R2=0.10，p=0.002），這表明他們的肺部菌羣發生了微生態失調。微生物羣可分為三種不同類型。特別是，羣集I中的微生物羣主要由可能的病原體所致，而其他羣集中的微生物則更為多樣。

通過進一步調查每個羣集的種類，研究團隊發現，III型細菌主要是在口腔和呼吸道中經常觀察到的共生菌，而II型細菌則主要是環境微生物，因此高度懷疑這其實是受到了污染。因此，微生物羣要麼富含病原體（I型），要麼富含共生菌（III型），或者由於低微生物載量低而無法確定（II型）。

在所測的八個感染者中，六個新冠病毒感染者樣品中的微生物羣是富含病原體的，而其他兩個樣品則富含共生菌。此外，兩個宿主內新冠病毒變異數量過多的新冠病毒感染者樣品（感染者二、感染者六）均為富集病原體的。

論文提到，病毒的壓倒性優勢可能與更高的複製率有關，並且還可能潛在地刺激針對該病毒的強烈免疫反應，在這種情況下，預期會發生過多的宿主內突變。但是，由於該分析僅包括8名新冠病毒感染者，並且絕對微生物載量尚不清楚，因此需要更多數據進行進一步研究。

研究者們討論指出，除了肺炎組的微生物多樣性明顯低於健康對照組的特點外，他們沒有發現新冠肺炎患者中有任何特定的微生物羣模式，CAP患者中也沒有。一個可能的原因可能是肺炎患者使用了抗生素。然而，這並不適用於所有肺炎樣本，因為在一些樣本中發現了相當比例的細菌，包括2例新冠肺炎患者。

目前已知的是，病毒感染，尤其是呼吸道病毒的常見併發症，繼發性細菌感染往往導致發病率顯著增加。因此，部分新冠肺炎患者BALF中細菌水平升高可能增加繼發性感染的風險。在臨牀資料中，新冠肺炎患者的繼發性感染率在1%-10%之間。然而，細菌相對丰度/效價與感染之間的定量關係尚不清楚。

論文原文鏈接：https://academic.oup.com/cid/advance-article/doi/10.1093/cid/ciaa203/5780800?searchresult=1#

（澎湃新聞記者 賀梨萍）