細胞子刊：中國團隊發現新蝙蝠冠狀病毒，力證新冠起源於自然

最新的一項研究顯示，去年在雲南勐臘縣獲得的蝙蝠樣本中發現一種新冠狀病毒，該病毒在最長編碼基因區1ab與新冠病毒（SARS-CoV-2）一致性達到97.2%。同時，研究團隊在這一新冠狀病毒中S蛋白（刺突糖蛋白）S1和S2交界處也發現插入了三個殘基PAA，他們由此認為SARS-CoV-2在S1和S2的交界處的四氨基酸插入並非“人工痕跡”，有力證明了其起源於自然。

當地時間5月10日，《細胞》（Cell）旗下子刊《現代生物學》（Current Biology）在線發表了“A novel bat coronavirus closely related to SARS-CoV-2 contains natural insertions at the S1/S2 cleavage site of the spike protein ”，來自山東第一醫科大學、山東省高等學校新發傳染病病因流行病學實驗室、中國科學院西雙版納熱帶植物園、中國科學院北京生命科學研究所、中國科學院武漢病毒研究所、中國科學院微生物研究所、澳大利亞悉尼大學聯合團隊的研究人員給出了上述結論。

在這篇論文中，研究團隊報告了一種新的蝙蝠來源冠狀病毒，命名為RmYN02，是在2019年5月至10月期間從中國雲南省收集的227只蝙蝠的基因組分析中鑑定出來的。

研究顯示，RmYN02和新型冠狀病毒SARS-CoV-2在全病毒基因組中的同源性為93.3%，在與SARS-CoV-2最接近的1ab基因中的同源性為97.2%。相比之下，RmYN02受體結合域（RBD）與SARS-CoV-2之間呈現低序列同源性（61.3%），可能不與血管緊張素轉換酶2（ACE2）結合。

然而，與SARS-CoV-2相似，RmYN02的特點是在S蛋白的S1和S2亞單位的剪切位點處有多個氨基酸插入。研究團隊認為，這就有力證明了這種插入事件在自然界中是可以發生的。

這些數據表明，SARS-CoV-2源於蝙蝠和其他野生動物中存在的病毒之間的多重自然重組。

該論文通訊作者為山東第一醫科大學基礎醫學院病原生物學研究所所長、山東省高等學校新發傳染病病因流行病學實驗室主任史衞峯，中國科學院微生物研究所病毒傳播預警與致病機制研究組組長、項目研究員畢玉海，中國科學院西雙版納熱帶植物園綜合保護中心景觀生態組組長、副教授Alice Catherine Hughes。該研究此前於當地時間3月5日發表在預印本網站bioRxiv上。

新冠病毒起源尚不明確，野生動物中仍有大量冠狀病毒

SARS-CoV-2在中國及其他地區造成了前所未有的肺炎流行，已引起全球範圍的公共衞生關注。儘管蝙蝠被認為是SARS-CoV-2 最有可能的自然宿主，但病毒的起源仍不清楚。

系統發育分析表明，SARS-CoV-2是一種不同於SARS-CoV和MERS-CoV的新型冠狀病毒。到目前為止，與SARS-CoV-2最密切相關的病毒是RaTG13，它是中科院武漢病毒所石正麗團隊於2013年在雲南採集的一隻中華菊頭蝠標本中分離發現。RaTG13病毒株和新冠病毒具有96.1%的核苷酸同源性、92.9%的S基因同源性。這些數據再次説明蝙蝠是冠狀病毒的重要宿主。

然而，值得注意的是，香港大學公共衞生學院新發傳染病國家重點實驗室管軼教授、廣西醫科大學胡豔玲教授團隊，以及華南農業大學、嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室沈永義教授、肖立華教授團隊兩個研究小組此前均報告了存在於馬來穿山甲的SARS-CoV-2相關冠狀病毒，這些穿山甲通過非法走私進入廣西和廣東。

研究團隊提到，儘管在全基因組水平上，這些穿山甲中檢測到的冠狀病毒與SARS-CoV-2的距離要遠於RaTG13與SARS-CoV-2的距離，但它們在S蛋白的受體結合域(RBD)上與SARS-CoV-2非常相似。

因此，儘管目前還不清楚穿山甲是否是SARS-CoV-2傳播到人過程中的中間宿主，但它們可能在冠狀病毒的生態學和進化中發揮重要作用。

他們認為，這些在穿山甲中發現的病毒可以表明，在野生動物中仍有大量的冠狀病毒樣本，其中一些可能直接參與了SARS-CoV-2的出現。

SARS-CoV-2和幾種代表性蝙蝠來源冠狀病毒序列比較。

一種新的蝙蝠來源冠狀病毒，命名RmYN02

論文中提到，2019年5月至10月,研究團隊從雲南勐臘縣的227只蝙蝠中一共收集了302個樣本。這些蝙蝠屬於20個不同種類，大多數樣本從馬來菊頭蝠Rhinolophus malayanus（n=48, 21.1%）、中蹄蝠Hipposideros larvatus （n=41，18.1%）和小褐菊頭蝠Rhinolophus stheno（n=39,17.2%)中獲得。樣本來源於多種組織，包括翼膜（219）、肺（2）、肝（3）和糞便（78）。

除了3只蝙蝠外，其餘所有蝙蝠均為在活着時取樣並被釋放。

利用新一代宏基因組測序技術，研究團隊首先鎖定了2個初步的一致序列。這些序列產生的樣本來自於2019年5月6日至7月30日期間的11份馬來菊頭蝠糞便。經過一系列驗證步驟，研究團隊得到一個部分（23395bp）和一個完整（29671bp）的蝙蝠冠狀病毒基因組序列，分別命名為BetaCoV/Rm/Yunnan/YN01/2019 （RmYN01）和BetaCoV/Rm/Yunnan/YN02/2019 （RmYN02）。

相比之下，RmYN02與SARS-CoV-2密切相關，表現出93.3%的核苷酸序列一致性，但從全長基因組層面來説，RaTG13和SARS-CoV-2的一致性更高(96.1%)。RmYN02和SARS-CoV-2在大多數基因組區域(如1ab、3a、E、6、7a、N和10)非常相似（>96%序列一致性）。特別是，RmYN02在最長編碼基因區1ab (n=21285)與SARS-CoV-2一致性達到97.2%。

不過，RmYN02和SARS-CoV-2在S基因中的序列一致性（核苷酸71.8%，氨基酸72.9%）遠低於RaTG13和SARS-CoV-2之間的97.4%。另外值得注意的是，RmYN02和SARS-CoV-2在RBD中的氨基酸同源性僅為62.4%。而來自廣東的穿山甲冠狀病毒和SARS-CoV-2在RBD中的氨基酸同源性為97.4%，也是在RBD區域目前和SARS-CoV-2最接近的。

圍繞SARS-CoV-2的同源模型、體外實驗和S蛋白的三維結構分析結果都表明，SARS-CoV-2和SARS-CoV一樣，也可以利用ACE2作為細胞受體。研究團隊也同樣使用同源模型分析了RmYN02、RaTG13和兩個穿山甲CoVs的RBD。

RmYN02和代表性冠狀病毒RBD結構的同源建模和結構比較。

研究發現，RmYN02 RBD中的氨基酸缺失在受體結合位點附近形成了兩個比SARS-CoV-2 RBD短的環。重要的是，在SARS-CoV、SARS-CoV-2、RaTG13、穿山甲/MP789/2019、穿山甲/GX/P5L/2017的外子域（external subdomain ）保守的二硫鍵在RmYN02中缺失了。研究團隊推測，這些缺失可能導致構象變化，從而減少RmYN02 RBD與ACE2的結合，甚至導致不結合。

當然也有可能的一種情況是，包括RmYN02、ZXC21和ZC45在內的環缺失的SARS相關冠狀病毒，使用了一種我們目前未知的受體。

值得一提的是，此前有研究認為，RBD中的6個氨基酸殘基(L455、F486、Q493、S494、N501和Y505)是SARS-CoV-2與ACE2有效受體結合的主要決定因素。與同源建模一致，穿山甲/MP789/2019在所有6個位置上都具有與SARS-CoV-2相同的氨基酸殘基。相比之下，RaTG13、RmYN02和RmYN01與SARS-CoV-2均只在1個位置上有相同的氨基酸殘基。

研究團隊認為，這種進化模式是重組和自然選擇的複雜結合的表現。

系統發育樹：A 全長基因組；B、S基因；C、RBD ；D、RdRp(RNA依賴的RNA聚合酶

研究團隊還對RmYN02、RaTG13、SARS-CoV-2和穿山甲中的蝙蝠冠狀病毒進行了系統發育分析。與先前的研究相符，穿山甲beta-CoVs形成兩個亞型。然而，論文中提到，穿山甲是否是這些病毒的天然蓄水池，或者它們從蝙蝠或其他野生動物中獨立獲得，這都需要進一步驗證。

更值得注意的是，在大多數病毒基因組中，RmYN02與SARS-CoV-2的親緣關係最近，儘管這兩種病毒之間仍然有一段較長的分支距離。S基因樹顯示，SARS-CoV-2離RaTG13較近，和RmYN02較遠，這表明後者在S基因經歷了重組。在RBD的系統發育樹上，SARS-CoV-2和pangolin-CoV/GD最密切相關，與蝙蝠病毒都較遠，再次表明重組發生。最後，完整的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp)基因(在RNA病毒的系統發育分析中經常被使用)系統發育分析顯示，RmYN02、RaTG13和SARS-CoV-2形成了一個與穿山甲病毒完全不同的亞羣。

SARS-CoV-2是自然起源，可能通過重組獲得

類似禽流感病毒(AIVs)血凝素(HA)蛋白的方式，冠狀病毒的S蛋白在功能上分裂成兩個亞基S1和S2。而在某些AIV亞型的剪切位點上插入多鹼基氨基酸被認為與增強致病性有關。

值得注意的是，SARS-CoV-2的特徵之一即為在S1和S2的交界處有一個四氨基酸的插入，這在其他β冠狀病毒的其他譜系中沒有觀察到過。這種被稱為弗林蛋白酶剪切位點的插入是SARS-CoV-2獨有的，目前在所有檢測的SARS-CoV-2序列中都發現存在。

研究團隊此番在RmYN02中S1和S2交界處也發現插入了三個殘基PAA，他們認為這是非常重要的。“雖然SARS-CoV-2插入的殘基(以及由此產生的核苷酸)與RmYN02中的殘基不同，但可以表明它們是一個獨立的插入事件，它們在野生動物(蝙蝠)中出現強烈表明它們是自然起源的，可能是通過重組獲得的。”

因此，這些數據有力地表明瞭SARS-CoV-2的自然起源。

此外，研究團隊再次確定了RmYN02的蝙蝠宿主為馬來菊頭蝠（Rhinolophus malayanus），和一種馬來菊頭蝠標本中獲得的序列（GenBank accession MK900703 ）100%一致。

馬來菊頭蝠和中華菊頭蝠都廣泛分佈於中國西南部和東南亞地區。論文中提到，一般來説，這些蝙蝠不會長距離遷移，羣居性很強，很可能生活在同一個洞穴中，這可能會促進它們之間的病毒交換和重組的發生。

值得注意的是，科學家從肛門拭子中發現了RaTG13，從糞便中發現了RmYN02。因此，糞便是蝙蝠將病毒傳播給其他動物，特別是能夠利用洞穴環境的物種的一種簡單但可行的方法。