新冠檢測為何有假陰性？北京疾控中心等發現：或因樣本熱滅活

自2019年底新冠疫情暴發，核酸檢測對患者診斷和疾控管理發揮了重要作用。然而實際檢測中，卻經常有假陰性的情況發生。假陰性可能會導致病毒攜帶者被漏診，尚無康復的患者誤出院，以及輸血中的一些潛在安全問題。

那麼假陰性的原因有哪些？來自中國的研究發現，對檢測樣本的熱滅活，可能是假陰性的一大原因。當地時間5月15日，美國臨牀化學協會與牛津大學出版社合作出版的國際領先的臨牀實驗室科學期刊Clinical Chemistry刊發了來自北京疾病預防控制中心、北京市預防醫學研究中心、首都醫科大學、中國醫學科學院老年醫學研究院、中國醫學科學院北京協和醫學院和北京醫院的論文“Potential False-Negative Nucleic Acid Testing Results for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 from Thermal Inactivation of Samples with Low Viral Loads”。

論文稱：為了安全，國家衞健委相關指南要求在提取樣本核酸前需將樣本置於56℃以上以滅活病毒。但是，熱滅活本身可能會破壞作為單鏈RNA的新冠病毒的核酸完整性，並在RT-PCR測試中出現假陰性。

這項研究的通訊作者為北京市疾控中心傳染病地方病控制所所長、研究員王全意和來自中國醫學科學院老年醫學研究院的任思楣。

研究團隊調查了熱滅活是否會影響病毒核酸檢測的結果。研究者檢查了熱滅活對SARS-CoV-2定量RT-PCR結果的影響，特別是對於攜帶低病毒載量的標本的假陰性結果的比率。研究者還探討了不同樣品類型，樣品保存時間和化學滅活方法對核酸檢測的影響。

目前，中國已有100多家企業開發了用於新冠核酸檢測的試劑盒，其中9個已獲得國家藥品監督管理局的批准。經過國家藥品監督管理局批准的試劑盒，在臨牀試驗中對確診病例的樣品均顯示出90％以上的高靈敏度。但是，在實際的臨牀環境中，疑似患者的陽性診斷率沒有評估的那麼高。許多疑似患者表現出與肺炎一致的典型臨牀症狀或影像學研究，但在RT-PCR測試中未發現陽性。這就提出了一個問題，是什麼導致這些臨牀上的假陰性？

國家藥品監督管理局批准的試劑盒通常來説質量都是非常高的，而操作者也不太可能因為核酸提取和檢測程序不當產生大量假陰性。那麼，臨牀上收集的樣品類型（比如，是熱滅活還是化學滅活）可能是導致RT-PCR測試性能低於預期的主要原因之一。

考慮到SARS-CoV-2是單鏈RNA病毒，分離其基因組需要謹慎處理樣品，並保持良好的實驗室操作規範。SARS-CoV-2具有很強的傳染性，許多實驗室在提取RNA之前，已對樣本進行56-60°C滅活30-60分鐘，以保證操作人員的安全。儘管學術界懷疑這種預處理可能會影響低病毒載量樣品中SARS-CoV-2的檢測，但對其影響的定量分析仍然不足。此次研究中，研究者調查了熱滅活對SARS-CoV-2核酸檢測結果的定量影響，並評估了由於熱滅活引起的假陰性率。研究者進一步研究了不同樣品類型，樣品保存時間和化學滅活方法對核酸檢測的影響。

該研究顯示，從確診的COVID-19患者的標本經過熱孵育後，在RT-PCR測試時Ct值較熱滅活前的樣板升高（編注：Ct值與病毒載量成反比，Ct值升高，意味着測試出的病毒載量偏低）。此外，在至少一項平行測試中，加熱滅活後的的弱陽性樣品中約一半（15個樣品中的7個，佔46.7％）成為RT-PCR陰性。研究者發現，與熱滅活相比，使用胍鹽裂解法保存這些樣品對RT-PCR結果的影響較小，假陰性更少（15個樣品中的2個，佔13.3％），Ct值的增加也明顯更少。

本研究採用的樣本來自北京23名已確診的新冠患者。研究收集了19個咽拭子，2個痰樣本和2個糞便樣本。將4支咽拭子和痰標本保存在3 µmL標準病毒運輸液（VTM）中。其他15支弱陽性喉拭子保存在3 µmL標準病毒運輸液或者3 µmL的化學滅活的緩衝液中。糞便樣本保存在採樣管中。所有樣品都保持在4°C並在4小時內轉移到實驗室。

研究發現熱滅活可以導致RT-PCR檢測中病毒核酸的可檢測量減少和Ct值增加（Ct值與病毒載量成反比），這一結果與最近的豬流行性腹瀉病毒模型的研究結果一致。熱滅活對攜帶高病毒載量的標本的定性結果沒有顯著影響。但是，對於弱陽性樣本（Ct值範圍為33.37至36.89），熱滅活可能是實驗室檢測SARS-CoV-2時假陰性結果的可能原因之一。

據推測，熱失活可能會對早期感染患者的檢測產生潛在影響，導致核酸檢測無法在患者病毒載量尚低時就檢測出來。在研究中，近一半的弱陽性樣本（15個樣本中的7個，佔46.7％）顯示假陰性結果。這7個樣本的平均Ct值（36.25）相當於約700拷貝/ mL，這也可能是熱敏感的可能閾值。

因此，研究者呼籲，迫切需要提高實驗室檢測的準確率。採用化學滅活劑，例如胍鹽類的RNA樣本保存製劑，可以視為避免生物安全風險的替代方法。研究結果表明，與低病毒載量樣品中的熱滅活相比，這些滅活劑可能有更好的測定性能和檢測率。但是，化學滅活劑的狹窄適用性，有限的可獲得性和潛在的環境污染，限制了它們在SARS-CoV-2測試中的應用。

附：實驗結果