《自然》刊發上海團隊研究：新冠進化穩定，兩個分支臨牀區別不大
來自上海的研究團隊通過研究1月下旬至2月期間的新冠患者的病毒樣本，發現新冠病毒可劃分為兩大分支，分別從一個共同祖先獨立進化而來。不過，這兩大分支病毒在臨牀上對患者致病效應無顯著區別。COVID-19疾病發展嚴重程度的決定因素主要還是與患者年齡、基礎疾病、淋巴細胞減少和相關的細胞因子風暴等密切相關。
上述研究來自當地時間5月20日頂級學術期刊《自然》（Nature）以“加快評審文章 (Accelerated Article Preview) ”形式在線發表的一項研究，題為“Viral and host factors related to the clinic outcome of COVID-19”。該研究由來自復旦大學附屬上海市公共衞生臨牀中心、上海交通大學附屬瑞金醫院、上海血液學研究所、醫學基因組學國家重點實驗室、中科院植物生理生態研究所、上海巴斯德研究所和上海營養與健康研究所等多家上海科研和醫療單位合作完成。研究團隊分析了1月下旬至2月期間，在上海公共衞生臨牀中心收治的326例新冠患者的SARS-CoV-2病毒樣本。
通訊作者為上海公共衞生臨牀中心黨委書記盧洪洲教授，中國工程院院士、上海交通大學醫學院教授、上海血液學研究所所長陳賽娟，與上海交通大學王升躍研究員。
研究團隊對上海公共衞生臨牀中心於1月20日至2月25日期間收治的326例新冠肺炎確診病例的臨牀、分子和免疫學資料進行了分析。自1月27日收到第一批樣本起，瑞金醫院的轉化醫學國家重大科技基礎設施重大疾病基因組研究平台在一個多月時間內完成了112個病例的SARS-CoV-2基因組高質量測序。這些序列與全球流感數據共享計劃(GISAID)中的基因組序列類似，呈現較為穩定地進化過程，顯示該病毒可能在疫情早期就已適應在人類宿主中傳播。
研究同時發現，疫情早期階段存在兩種有不同接觸史的主要病毒分支，但兩個分支的傳播性、致病性和臨牀表現等方面無顯著差異，未發現與COVID-19重症患者有顯著相關的病毒變異序列。
從臨牀和免疫學研究發現，COVID-19患者淋巴細胞明顯減少，尤其是重症患者CD4+和CD8+T細胞呈顯著進行性下降趨勢，且炎性細胞因子IL-6和IL-8明顯增高。
研究團隊認為，COVID-19疾病發展嚴重程度的決定因素主要與患者年齡、基礎疾病、淋巴細胞減少和相關的細胞因子風暴密切相關，這些因素成為疾病向重症轉變的關鍵預警因子。依據上述臨牀分析採取早期針對性干預措施，將有助於阻止疾病向重症發展。
新冠病毒穩定進化，可能在疫情早期已適應在人類宿主中傳播
研究定義了四類感染病例。5例患者為無明顯發熱、呼吸系統症狀或放射學表現的無症狀患者。大部分患者（293例）為輕症患者，有發熱和肺炎表現。12例為重症患者，在24-48小時內出現呼吸困難和肺內毛玻璃樣陰影擴大的症狀。另有16例患者惡化為急性呼吸窘迫綜合徵（ARDS），需要機械通氣或體外膜氧合（ECMO），屬於危重患者。
截至4月1日，315名患者（96.63%）已出院，6人（1.84%)死亡。
研究團隊對112個樣本（痰、口咽拭子）進行測序，與全球第一個公佈的基因組（Wuhan-Hu-1）相比，在9個蛋白編碼區共鑑定出66個同義變異和103個非同義變異。ORF1ab、S、ORF3a、E、M和ORF7a的替換率相似（約3.5×10^-4每個位點每年），而ORF8（9.51×10^-4每個位點每年）和N（1.05×10^-3每個位點每年）的變異率更高。
在來自上海樣本基因組中重複出現的突變的與GISAID數據庫中已公佈的病毒序列一致，呈現較為穩定的進化過程，顯示該病毒可能在疫情早期就已適應在人類宿主中傳播。
兩大分支新冠病毒，最早疫情發生並不侷限於華南海鮮市場
隨後，研究團隊使用了其中的94例病毒基因組和GISAID數據庫中的221個SARS-CoV-2序列進行系統發育分析。研究確定病毒主要為兩大分支，兩大分支中均包含來自20191年12月初診斷的病例；分支I包括幾個亞支，分支II與分支I的區別在於兩個相關的變異ORF8:p.84L>S (28144T>C)和ORF1ab:p.2839S (8782C>T)。
上海樣本的序列在兩個主要分支及其亞支中均有發現，研究認為這表明上海的新冠病例有多個病毒來源。在上海沒有觀察到明顯的分支/亞支擴張。
此外，確認有華南海鮮市場接觸史的6位患者均集中在其中一個分枝中（分支 I），同期診斷的另外3例和華南海鮮市場沒有接觸史的病例均屬於分支II，提示疫情發生並不侷限於華南海鮮市場。
論文指出，這兩種主要的單倍型可能代表了來自於2019年12月初在武漢由共同祖先獨立進化而來的兩種譜系，其中只有一種（分支I）和華南海鮮市場接觸有關，市場內密集的攤位、攤販和顧客可能促進了人際傳播。
與此一致的是，一項針對12月18日前武漢地區最早的病例流行病學調查發現，2例患者與華南海鮮市場有關聯，5例患者與之無關聯。他們的系統發育分析表明，疫情最早可能發生在2019年11月下旬。
研究團隊還比較了感染分支I或分支II病毒患者的臨牀表現。他們發現，在疾病嚴重程度（p=0.88）、淋巴細胞計數（p=0.79）、CD3 T細胞計數（p=0.21）、C反應蛋白（p=0.83）或D-二聚體（p=0.19）以及發病後排毒時間（p=0.79）方面均沒有統計學差異。因此，研究團隊認為，這兩分支病毒儘管基因組序列發生變化，但表現出相似的致病效應。
同樣，在疾病嚴重程度和13個最常見的變異（同義和非同義）之間也沒有發現顯著的相關性。
與COVID-19疾病發展嚴重程度相關的宿主因素
這項研究的一個顯著特徵是，部分感染者（5例，1.53%）雖然可以檢測到明顯的排毒，但未出現明顯症狀。相比之下，在輕度和危重症病例中觀察到肺部單側和雙側混濁病變，危重症患者僅在兩天內就迅速惡化。
研究團隊進一步分析了患者的免疫生化指標。COVID-19的一個顯著特徵是進行性淋巴細胞減少，尤其是重症和危重症（入院後初步檢測結果，p=6×10^-6）。對淋巴細胞亞型的詳細分析顯示，CD3+ T細胞受影響最顯著（p<10^-6）， CD4+和CD8+ T細胞具有相似的趨勢（CD4+ T細胞，p<10-6；CD8+ T細胞，p=1×10^-5）。
值得注意的是，T淋巴細胞的變化不僅在危重病例中有統計學意義，而且在其他三類（無症狀、輕度和重度）中也有統計學意義（CD3+ T細胞，p=0.013；CD8+ T細胞，p=0.004）。相比之下，CD19+ B細胞雖然在危重患者中有顯著下降（p=1×10^-5），但在無症狀、輕症、重症病例中無明顯變化（p=0.47）。
研究團隊進一步檢查了每組數據後得出，隨着病情的惡化，CD3+ T淋巴細胞（在發病後第7、8、11、14-18、22-25、28、29天檢測）呈逐漸下降趨勢（p<0.05），CD4+和CD8+ T細胞也呈類似趨勢。然而，NK細胞（CD16+、CD56+）或B細胞（CD19+）沒有這種現象。
接下來，研究比較了共病組的臨牀參數，發現雖然共病組的中位年齡較高（p=0.02），但共病組疾病進一步發展的風險的確顯著提高（p=0.01）。事實上，單變量邏輯迴歸分析表明年齡（p < 0.0001）、入院時淋巴細胞計數（p < 0.0001）,合併症（p = 0.01）和性別（p = 0.014）都是與新冠嚴重程度相關的主要因素。多變量分析則表明,年齡（p = 0.002）和淋巴細胞減少（p = 0.002）是兩個主要的獨立因素，而合併症沒有達到統計學意義。
研究團隊在入院和治療期間檢測了患者血清中11個細胞因子（IFN-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17）的水平。其中，IL-6（p<10^-6）和IL-8（p=1×10^-5）變化最為顯著。值得注意的是，這兩種細胞因子與淋巴細胞計數呈負相關關係。
此外，研究團隊結合各組細胞因子的縱向數據，繪製其隨發病後時間的波動模式。他們收集了每位患者發病後第6天至第10天的最高IL-6數據，並將危重患者與非危重患者進行了比較。危重症患者組IL-6水平顯著升高（p=0.001）。從發病後第16天至第20天，患者IL-8水平也有類似的顯著差異（p=0.006）。
研究認為，這些數據表明，炎症細胞因子和SARS-CoV-2感染的發病機制之間有很強的聯繫。
研究在討論環節指出，這項研究進一步證實發現，CD3+ T細胞是感染患者的主要受抑制細胞類型，而CD19+ B細胞和CD16+CD56+NK細胞受抑制較少。事實上，淋巴細胞減少，尤其是CD4/CD8細胞數量減少，也是SARS-CoV-2感染的主要表現。
此外，研究對主要細胞因子的縱向監測表明，IL-6和IL-8與淋巴細胞計數呈負相關，IL-6動力學與疾病嚴重程度高度相關。
當然，目前病毒活性、細胞因子釋放與淋巴細胞減少的關係尚不清楚。研究團隊假設，包括“細胞因子風暴”和CD3+ T淋巴細胞減少在內的針對SARS-CoV-2的免疫病理反應，可能至少在一定程度上構成了疾病進展和死亡的潛在機制。