中國再添新冠滅活疫苗：由高福等學者領銜，高效、安全

新冠大流行威脅着全球公共衞生。為防控新冠疫情，人類迫切需要疫苗。來自中國科研團隊研發了名為BBIBP-CorV的新冠滅活疫苗，已在動物實驗顯示出了巨大的潛力：該疫苗高效、安全，在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物(食蟹猴猴子和恆河猴)體內均能誘導高水平的中和抗體滴度，2μg/劑便能提供針對新冠病毒的高效保護。同時，該候選疫苗是國內開發的第二個重要滅活疫苗，增加了國內的候選疫苗選擇。

以上成果來自當地時間6月6日國際權威學術期刊《細胞》（CELL）在線發表的重磅論文：《開發候選滅活疫苗BBIBP-CorV，對SARS-CoV-2能提供有效保護》（Development of an inactivated vaccine candidate, BBIBP-CorV, with potent protection against SARS-CoV-2）。

該論文通訊作者為中科院院士、中疾控主任高福、中國醫學科學院醫學實驗動物研究所所長秦川、中國疾控中心病毒病所應急技術中心主任譚文傑、清華大學教授婁智勇、中國食品藥品檢定研究院李長貴研究員、中國疾控中心生物安全首席專家、病毒病所黨委書記武桂珍等。

研究團隊來自北京生物製品研究所有限責任公司、中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所、國家人類疾病動物模型資源中心、國家衞生健康委員會人類疾病比較醫學重點實驗室、中國醫學科學院醫學實驗動物研究所、北京協和醫學院比較醫學中心、新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室、清華大學等。

研究者詳述了SARS-CoV-2滅活候選疫苗(BBIBP-CorV)的實驗性生產，該疫苗在小鼠、大鼠、豚鼠、兔子和非人靈長類動物(食蟹猴猴子和恆河猴)體內均能誘導高水平的中和抗體滴度，以提供對SARS-CoV-2的保護。在恆河猴的氣管內免疫接種中，研究使用2μg/劑量的BBIBP-CorV便可提供了對SARS-CoV-2的高效保護，同時沒有檢測到抗體依賴性增強（ADE）感染。此外，BBIBP-CorV在疫苗生產中表現出高效的生產力和良好的遺傳穩定性。

與SARS-CoV和MERS-CoV相比，SARS-CoV-2似乎傳播更快，導致對疫苗的迫切需求。迄今為止，三種候選疫苗(包括一種滅活疫苗、一種腺病毒載體疫苗和一種DNA疫苗)被報道以不同的效果保護恆河猴對抗SARS-CoV-2。滅活疫苗廣泛應用於新發傳染病的預防，其研製速度較快，針對新冠病毒的預防具有較好的開發前景。值得注意的是，新出現的證據顯示，SARS-CoV感染的可能存在抗體依賴性增強(ADE)，提示研製冠狀病毒疫苗時應特別重視安全性評價。

國內的首個滅活新冠疫苗來自國藥集團中國生物。國藥集團中國生物4月14日發佈消息，公司旗下新型冠狀病毒滅活疫苗獲得臨牀試驗後，一期臨牀已在河南焦作地區開展。

另一方面，由軍事科學院軍事醫學研究院生物工程研究所陳薇院士團隊和中國康希諾（CanSino）公司聯合開發的腺病毒5型（Ad5）載體疫苗也取得了重大進展。當地時間5月22日晚間，頂級醫學期刊《柳葉刀》（The Lancet）刊發一篇論文，題為“重組腺病毒5型載體COVID-19疫苗的安全性，耐受性和免疫原性：劑量遞增，開放標籤，非隨機，首次人類試驗”。陳薇等研究人員報告了在中國健康成年人中使用的Ad5載體COVID-19疫苗在接種後28天內的1期臨牀數據，初步評估疫苗的安全性、耐受性和免疫原性。

疫苗設計和生產

研究團隊從3名新冠住院患者的支氣管肺泡灌洗樣本及咽喉拭子中分離出3株SARS-CoV-2毒株，用於建立SARS-CoV-2滅活候選疫苗的臨牀前體外中和攻毒動物模型。3株新冠毒株分別是：19 ncov-cdc-tan-hb02 (HB02), 19 ncov-cdc-tan-strain03 (CQ01)和19 ncov-cdc-tan-strain04 (QD01)。這3株毒株散佈在系統發育樹的不同位置，表明其對SARS-CoV-2具有較好的代表性。

值得注意的是，所有這些毒株都是從Vero細胞中分離出來的，並已獲得世界衞生組織的疫苗生產認證。這些Vero細胞通過患者的咽喉拭子感染，而不是其他細胞系，以防止在病毒培養和分離過程中可能發生的突變。高效增殖和高遺傳穩定性是研製滅活疫苗的關鍵。他們首先發現在三種病毒株中，HB02株的88個Vero細胞複製效果最佳，產生的病毒產量最高(圖1a)。因此，研究者選擇HB02株進一步開發滅活SARS-CoV-2疫苗(BBIBP-CorV)。HB02株和其他從國內和國際來源的SARS CoV-2毒株的全基因組序列的比較表明：HB02毒株與其他病毒株同源，並證明了主要保護性抗原(刺突蛋白質)有100%的同源性。這説明具有廣泛對抗各種SARS-CoV-2毒株的潛力(補充圖1和補充圖2)。為了獲得適於高產的病毒培養基，研究者對HB02株進行了純化，並在Vero細胞中傳代產生了P1病毒培養基。將P1培養基在Vero細胞上進行適應性培養、傳代和擴增。研究者將經過7代適應化的毒株(BJ-P-0207)作為生產疫苗的原種子(BJ-P1)。為評價遺傳穩定性，研究者對其再傳代3次，得到P10病毒培養基。通過深度測序分析，我們對HB02株和P10株進行了全基因組測序，結果顯示它們的序列同源性大99.95%。此外，在P10原料病毒的全序列中，包括弗林分裂位點附近也沒有發現氨基酸變異，這些結果表明HB02毒株具有較高的遺傳穩定性，有利於進一步的發展。

為了高效製造，研究者建立了基於新型籃式反應器載體的BBIBP-CorV的原料生產策略(圖1b)。對Vero細胞中P7培養基的生長動力學分析顯示，培養基病毒能夠有效複製，在感染後48-72小時(hpi)達到最高滴度超過7.0 log10 CCID50，感染多重度(MOI)為0.01-0.3(圖1c)。為了滅活病毒產生，研究者在2-8℃，以1:40的比例將丙酸內酯與收穫的病毒溶液充分混合。病毒的3批滅活消除了病毒的感染性，驗證了滅活過程良好的穩定性和重複性(圖1d)。Western-blotting分析顯示，疫苗庫中含有病毒結構蛋白(保護性抗原)(圖1e)。負染色的電子顯微鏡圖像顯示橢圓形病毒顆粒，直徑約為100 nm(圖1f)。

BBIBP-CorV的免疫原性

為評估BBIBP-CorV的免疫原性，研究者採用不同免疫方案和不同劑量(2、4、8μg/劑)疫苗注射BALB/c小鼠。

單劑量免疫組在第0天(D0)以三種劑量腹腔給藥，分別是高(8 μg/劑)、中(4μg/劑)、低劑量(2μg/劑)的BBIBP-CorV，觀察注射後7、14、21、28天中和抗體(NAb)水平。結果表明，高、中、低劑量組的血清轉化速率在免疫後7天都達到100%，同時免疫效果與時間相關(圖2,補充表1) 。低、中劑量組的中和抗體水平在7、14和21天顯示顯著的變化，但21天到28天之間無顯著差異。在高劑量組中，僅在7 、14天觀察到顯著變化(圖2a)。

雙劑免疫組採用不同免疫方案(第0天/第7天、第0天/第14天、第0天/第21天分別進行免疫)。雙劑量免疫中的高、中、低劑量組在第二次免疫後7天的血清陽性達到100%(圖2 b,補充表1)。高、中劑量的雙劑免疫方案的免疫原性明顯高於單劑量免疫方案。採用第0天/第21天方案的第二次免疫後7天，其中和抗體水平最高。

研究者還測試了三劑免疫程序的免疫原性。他們在0天、7天和時14 天在小鼠腹腔接種三種劑量的疫苗，分別是高(8μg /劑)、中(4μg /劑)或低(2μg /劑)疫苗 (圖2c)。在第7、14、21、28天測定各組的中和抗體水平，在第一次免疫後第7天，三組血清轉化率均達到100%(圖2c，補充表1)。

結果顯示，三劑 (0天/7天/14天)免疫接種方案在第28天時的中和抗體水平，均高一劑免疫接種方案(圖2a和2c)。此外，他們分析了單劑、雙劑(0天/21天)和3劑(0天/7天/ 14天)免疫接種小鼠採用高、中、低劑量疫苗的中和抗體水平，並在第一次免疫後的28天檢測中和抗體水平，以保持相同的起止點。結果顯示，三劑量(0天/7天/14天)免疫接種方案的免疫原性高於單劑量和雙劑量免疫接種方案(圖2d)。

接下來他們在兔子、豚鼠、大鼠和小鼠等不同的動物模型中測量BBIBP-CorV的免疫原性。採用單劑量(D0)免疫接種方案對動物進行高劑量(8μg/劑)、中劑量(4μg/劑))和低劑量(2μg/劑))疫苗免疫，免疫後21天測定中和抗體水平。結果表明BBIBP-CorV具有良好的免疫原性，免疫後21天在所有動物模型中血清轉化率達到100%,(圖2 e,補充表1)。在三劑(0天 / 7天 / 14天)免疫組，食蟹猴、兔子、豚鼠、大鼠和小鼠接種高(8μg /劑量)中(4μg /劑量)或低(2μg /劑量)劑量的疫苗。免疫後21天在所有動物模型中血清轉化率達到100%。第一次免疫後21天的中和抗體水平表明，在兔和豚鼠模型中三劑(0天/7天/14天)免疫程序的高、中、低劑量下，均高於單劑(0天)免疫程序 (圖2 e 2 f,補充表1)。

非人靈長類動物模型中的保護作用

研究團隊評估了BBIBP-CorV對恆河猴的免疫原性和保護作用。

所有的恆河猴在第0天（D0）和第14天（D14）免疫2次。安慰劑組肌肉注射生理鹽水，兩組實驗組肌肉注射低劑量（2μg/劑）或高劑量（8μg/劑）BBIBP-CorV（圖3a）。病毒攻毒前，低劑量組和高劑量組的NAb GMT分別達到215和256(圖3b)。在D24（第二次免疫後第10天），所有恆河猴在麻醉下經氣管注射l06 TCID50的SARS-CoV-2。病毒感染後0 至7天，接種組和安慰劑組的體温在範圍內波動（圖3c，補充圖4a）。

另外,恆河猴在攻毒後血清生化參數保持不變（補充圖3）,這一結果表明,接種BBIBP-CorV不會在血清生化參數方面顯示出副作用。

接下來研究團隊用RT-PCR測定了恆河猴咽喉和肛門拭子的病毒載量。結果顯示，所有安慰劑組恆河猴在攻毒後整個評估期間均顯示並維持高病毒載量（圖3d、3e，補充圖4b和4c）。

低劑量組恆河猴咽喉拭子病毒載量則在5dpi時達到峯值（5.33 log10拷貝/毫升），7 dpi時下降至1.12 log10拷貝/毫升，明顯低於安慰劑組。值得注意的是，低劑量組的4只恆河猴中有3只在7 dpi時已無法檢測病毒載量。而高劑量組4只恆河猴咽喉拭子病毒載量均為陰性。另外，高劑量組4只恆河猴中的2只肛門拭子也未檢測到病毒載量。

7 dpi時，研究團隊對所有動物實施了安樂死，以確定肺組織中的病毒載量並進行病理檢查（圖3f、3g）。在低劑量和高劑量組中，所有恆河猴在任何肺葉中均未檢測到病毒載量，這與安慰劑組的結果有顯著差異（圖3f）。安慰劑組在左肺、右肺和右副肺檢測到高病毒載量，病理組織學分析為嚴重間質性肺炎。

然而值得注意的是，在安慰劑組的7個肺葉切片中，只有3個被檢測出有感染。論文指出，這可能是因為病毒在肺葉中的感染是動態變化的。

總的來説，接種BBIBP-CorV疫苗後，所有恆河猴的肺均正常，少數肺葉有局部輕度組織病理學改變（圖3g），這説明接種BBIBP-CorV疫苗可有效阻斷猴子SARS-CoV-2感染。

7dpi時，接受安慰劑治療的恆河猴產生低水平的NAb，滴度為1:16，而高劑量組NAb水平最高可達1:2048（平均1:860），低劑量組NAb水平最高達1:1024（平均1:512）（圖3b）。研究指出，這些結果表明，低劑量和高劑量的BBIBP-CorV對恆河猴SARS-CoV-2具有高效的保護作用，且沒有觀察到抗體依賴性增強感染。

安全性

研究團隊首先對大鼠（Sprague-Dawley）進行了單次肌肉注射實驗，以評估BBIBP-CorV的急性毒性。研究將20只大鼠分為2組（n=10, 5/性別），肌肉注射3倍劑量BBIBP-CorV （8μg/劑，24μg/大鼠），生理鹽水作為對照組。接種後連續觀察14天，第15天實施安樂死，評估系統解剖和觀察。

四組大鼠接種後連續14天內未見死亡或即將死亡，也未見明顯臨牀症狀。此外，實驗組與對照組在體重和餵養狀態上均無顯著差異（圖4a，補充圖4d）。安樂死後這些大鼠無組織病理學改變。

值得注意的是，大鼠單次肌肉注射的最大耐受劑量（MTD）為24μg/大鼠，相當於人體的900倍。研究團隊認為，這表明BBIBP-CorV對人體有潛在的良好安全性。

研究團隊隨後通過豚鼠肌肉注射和靜脈注射評估BBIBP-CorV引起的全身過敏反應。通過臨牀觀察和測量豚鼠體重，結果顯示敏化期間未見異常反應（圖4b）。陰性對照組（生理鹽水）和實驗組在D19、D26均未發現過敏反應症狀。陽性對照組（人血白蛋白）過敏反應高度陽性（1/6只動物為陽性，3/6只動物為強陽性，2/6只動物為極強陽性）。與之形成鮮明對比的是，低、高劑量試驗組D19、D26均無過敏反應，且過敏反應均為陰性。

研究團隊進一步評價了BBIBP-CorV對恆河猴的長期毒性。40只獼猴（20/性別）被分成4組（5/性別/組），分別肌內注射生理鹽水（組1）或2μg、4μg、8μg BBIBP-CorV（組2-4）。每組分別有3只在D25解剖，其餘2只在D36解剖，進行系統解剖和組織病理檢查。

在試驗期間，組2-4沒有出現死亡或即將死亡，淋巴細胞亞羣分佈（CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD20+,CD3+CD4+/CD3+CD8+）、細胞因子（TNF-αIFN-γ,IL-2，IL-4，IL-5和IL-6)、c反應蛋白、或體重觀察也沒有重大異常臨牀生理和病理指標 （圖4c-4e,補充圖4e）。

D25和D36時各劑量組的安樂死獼猴系統解剖未見異常。D25時組2-4均出現了肉芽腫性炎症，並在恢復期（D36）結束時依然存在，但與D25相比略有改善。獼猴只表現出局部刺激，表現為輕度到重度肉芽腫性炎症，但在注射後兩週沒有這種反應。8μg/劑實驗組表現出未觀察到的不良反應水平(NOAEL)。