Cell子刊：利用高度多重的ddPCR方法更好地檢測患者體內的HIV病毒庫_風聞

定量確定具有複製能力的HIV病毒庫對於評估治療策略至關重要。病毒生長試驗（viral outgrowth assay, VOA）低估了HIV病毒庫，因為它未能誘導所有具有複製能力的HIV前病毒（provirus，即病毒基因組整合進宿主細胞DNA的HIV）。針對HIV單個區域或兩個區域的HIV DNA測試（分別稱為單重測試和雙重測試）高估了HIV病毒庫，因為這些測試方法未能排除許多有缺陷的HIV前病毒。

基於PCR的測試方法是高度靈敏的，相比於VOA而言需要更少的血液。但是，在PCR測試方法中，人們通常針對單個保守性的靶點進行檢測，這會極大地過高估計具有複製能力的HIV 病毒庫的大小，這是因為大多數整合到宿主細胞DNA中的HIV前病毒都是缺陷性的，而且針對單靶點的PCR測試並不區分完整的HIV前病毒和具有DNA缺失和/或功能失活突變的HIV前病毒。可靠地估計遺傳上完整的HIV前病毒需要驗證HIV基因組上的多個區域的存在，以及所檢測每個區域上的靶序列是否來自相同的HIV前病毒。

微滴式數字PCR（ddPCR）提供了一種替代性選擇。在ddPCR中，PCR反應液（包括模板DNA）被分割成數千個單獨的液滴，每個液滴的PCR檢測結果分別報告。2019年報道的一種ddPCR測定方案利用了此類多重方法，在每個液滴內探測HIV-1基因組的兩個區域。

在一項新的研究中，美國研究人員使用兩種針對HIV基因組的3個區域（三重）的ddPCR測定方法（下稱測定方法1和測定方法2）來開發一種5區域測試方法（這兩種三重ddPCR測定各自針對兩個獨特的HIV基因組區域，但共同針對1個重疊區域，從而允許批間質量控制）。通過結合這兩種平行的三重ddPCR測定方法，這些作者有信心對真正完整的HIV-1病毒基因組進行定量確定。作為進一步的改進，他們優化了其中的一種特異性定量確定T細胞的多重ddPCR測定方法，以便準確地將定量確定的數量與待研究的HIV靶細胞的數量進行正常化。這個額外的步驟對於組織活檢特別有用，因為與血液相比，組織中的細胞羣體難以分離和純化。相關研究結果發表在2021年4月20日的Cell Reports Medicine期刊上，論文標題為“A highly multiplexed droplet digital PCR assay to measure the intact HIV-1 proviral reservoir”。

具體而言，測定方法1的三個HIV靶點位於HIV pol基因的3’端、tat基因和env基因，而測定方法2的三個HIV靶點位於長末端重複序列（LTR）/gag區域、pol基因的5’端和env。每種測定方法中，針對每個HIV靶點設計特異性的引物和探針。在每種測定方法的三個HIV靶點中，有兩個使用相同的染料進行探針檢測，但濃度不同，以便能夠在熒光振幅的X/Y圖上區分不同的HIV靶點。這使得這些作者能夠對含有不同靶點組合的液滴進行定量確定。針對env的引物和探針在測定方法1和測定方法2中是相同的，在201個臨牀樣本中，這兩種測定方法的env性能幾乎相同。此外，在這些臨牀樣本中，五對引物/探針檢測靶點的失敗率極低：gag 0.5%；3’ pol 1%；env 3.1%（兩種測定方法均如此）；tat 3.6%；5’ pol 6.3%。

兩種HIV-1三重ddPCR測定方法的設計，圖片來自Cell Reports Medicine, 2021, doi:10.1016/j.xcrm.2021.100243。

這些作者利用這種5區域測試方法評估了含有這5個區域的HIV前病毒的數量。他們評估的HIV前病毒數量平均比配對的定量VOA方法高12.1倍並且與後者相關（Spearman’s ρ = 0.48），但是他們以此估計的HIV病毒庫要比之前的DNA測定方法顯著減少。

這些作者將他們的測試方法使用於來自接受抗逆轉錄病毒藥物（ART）治療的HIV感染者的縱向血液樣本和粘膜樣本。在這些患者中，完整的HIV前病毒在血液CD4+T細胞中的衰減速度快於有缺陷的HIV前病毒，而且完整的HIV前病毒在粘膜T細胞和循環T細胞中的頻率相似。

參考資料：

Claire N. Levy et al. A highly multiplexed droplet digital PCR assay to measure the intact HIV-1 proviral reservoir. Cell Reports Medicine, 2021, doi:10.1016/j.xcrm.2021.100243.