【疫苗簡史】新冠疫苗為啥沒有減毒活疫苗問世？開發一款減毒活疫苗到底有多難_風聞

作者 | 王新宇

轉載自公眾號“華山感染”

今天我們就要和大家介紹一款減毒活疫苗—黃熱病17D疫苗開發的故事，聊一聊開發一款成功的減毒活疫苗到底有多難。

第一步 認識疾病

黃熱病是一種高度致命的病毒性傳染病，導致肝、腎和心肌損傷，出血和休克。目前僅在南美和非洲的熱帶地區發生流行。該病的傳播媒介是一種叫做埃及伊蚊的蚊蟲。黃熱病不但可以感染人類，也可以在非人類靈長類動物中傳播。因此黃熱病不能像天花一樣做到根除，唯一可靠預防該疾病的方法是對易感的人羣進行疫苗接種。

在歷史上，黃熱病曾經在整個美洲和西非地區肆虐。歷史上影響最大的一次疫情發生於1793年，在當時美國羽翼未豐的聯邦首都費城，那裏佔總人口10％的人因為感染黃熱病而喪生。當時，黃熱病被廣泛認為是由污物，污水和腐爛的有機物引起的一種空氣傳播的“ 瘴氣”。

小説《熱病1793》記錄了1793年費城暴發黃熱病的恐怖場景

在沒有找到致病因素的情況下，疫苗接種是一個遙不可及的目標。一直到1878年，在密西西比河下游地區的一次暴發仍然有20,000人死亡。如果你是福爾摩斯探案集的忠實粉的話，一定記得有一篇叫做“黃麪人”的短篇小説，裏面女主人公的前夫就是死於美洲暴發的黃熱病。

福爾摩斯探案集-黃麪人中女主角的前夫死於黃熱病

十九世紀下半葉，包括卡洛斯·芬萊在內的幾位醫生提出，黃熱病是通過蚊子傳播的。當時疾病的細菌理論和科赫關於微生物因果關係的假設已經被歐洲主流科學所接受，芬萊在此基礎上提出蚊子攜帶黃熱病的“病菌”。

古巴流行病學家卡洛斯·芬萊發現黃熱病是通過蚊子從感染的人傳播到健康的人的

1900年，時值美西戰爭期間，黃熱病在古巴島上流行，對佔領的美軍構成了嚴重威脅。由美軍少校沃爾特·裏德（Walter Reed）領導的黃熱病委員會證明該病原是一種可過濾的病毒，並且可通過直接注射血液或由埃及伊蚊傳播。

沃爾特·裏德（1851-1902）

他們發現如果是通過蚊子傳播，蚊子叮咬患者以後，要經過12天的體外潛伏期才具有傳染性，也就是病毒在蚊子體內還有一個複製的過程。他們還發現人類如果被具有傳染性的蚊子叮咬後，到發病中間也需要間隔3-6天的潛伏期。

第二步 找到病原體

雖然之後，很多人也證實了裏德的發現，但從病因學上的“病毒”卻沒有得到分離和鑑定。

美國陸軍外科醫生沃爾特·裏德少校及其對黃熱病起因的發現是醫學和人類歷史領域最重要的貢獻之一

一直到1927年，廣泛的黃熱病席捲了非洲沿海地區，由洛克菲勒基金會建立的西非黃熱病委員會成員亞歷山大·馬哈菲，在加納將一名名叫阿西比（Asibi）的28歲的病人血液接種到恆河猴體內。四天後，猴子垂死並顯示出與黃熱病相一致的肝損傷。將該猴子的血液再次接種第二隻動物後，又一次引起了臨牀黃熱病。

首先從這位叫Asibi的加納患者體內分離到了黃熱病毒

於是黃熱病的病原終於被找到了。

第三步 讓病毒在實驗室活下去

黃熱病委員會的研究人員通過在猴體內連續直接傳代和通過埃及伊蚊間接傳代建立了Asibi病毒株，而Asibi將會是此後17D疫苗的母本病毒株。除了確定黃熱病的致病因子並確認它是可過濾的病毒因子外，研究人員還證實恆河猴是易感宿主，這為測試未來的候選疫苗提供了寶貴的研究工具。

洛克菲勒西非黃熱病研究委員會在西非實地

就在差不多時候，法國巴斯德研究所位於達喀爾的分支，從一名敍利亞患者中分離了黃熱病病毒，起名為“法國病毒株”。

分離到Asibi病毒株和法國病毒株是開發疫苗的關鍵。

第四步 試試滅活疫苗行不行

使用新分離的病毒進行主動免疫的最早嘗試是1928年在倫敦惠康研究實驗室的愛德華·欣德爾，他使用從感染了法國病毒株的猴子肝臟和脾臟組織製備的疫苗，並用福爾馬林或甘油-酚滅活。皮下注射滅活疫苗的恆河猴在一週後再接種大劑量病毒後仍存活下來，而未接種疫苗的動物死亡。

但是當時缺乏有效的病毒繁殖、效價測量和滅活過程控制方法，從而阻礙了滅活疫苗的製備。一些製劑可能包含激發免疫的殘留活病毒，而另一些則在滅活過程中降解且缺乏效力。 

1929年，洛克菲勒研究所國際衞生部實驗室的後來主任威爾伯·索耶和紐約洛克菲勒基金會的同事生產了由感染黃熱病的恆河猴血清經過化學處理製造的疫苗。這些製劑的的抗原活性和安全性都不一致，導致研究人員得出結論，化學處理劇毒病毒不太可能產生安全可靠的疫苗。

黃熱病滅活疫苗的嘗試就此宣告失敗。

第五步 建立小動物模型

1928年，哈佛醫學院熱帶醫學系主任安德魯·沃森·塞拉茲（Andrew Watson Sellards）從達喀爾巴斯德研究所帶回了含有法國黃熱病毒株的恆河猴肝感染樣本。

馬克斯·泰勒（Max Theiler）被委託將此材料用於開發感染的小動物模型。

馬克斯·泰勒（1899–1972）

泰勒出生於南非的比勒陀利亞，曾在倫敦聖托馬斯醫院接受醫學培訓。泰勒用具有感染性的達喀爾猴肝懸浮液在腦內接種成年的小鼠；所有動物均死於腦炎，無肝損害跡象。隨後將這些小鼠的腦組織接種到恆河猴中，引起典型的致命黃熱病，並伴有肝病。

小鼠模型的成功代表了黃熱病研究的一個里程碑。

第六步 通過小動物連續傳代，得到穩定的病毒

如果大家還記得，將近50年前，巴斯德（Pasteur）就曾經在疫苗研製過程中通過脊髓內或腦內途徑感染了狗，猴，豚鼠和兔子的狂犬病。而泰勒就是沿襲了巴斯德的做法。

泰勒嘗試通過小鼠腦內一系列連續傳代來減毒黃熱病病毒。他發現接種經過29和42次傳代後接種小鼠腦物質的猴子在感染中倖存下來，沒有臨牀症狀，並且對強病毒的攻擊具有抵抗力。

病毒在小鼠中的連續傳代過程中其嗜神經性增加了，這表明連續傳代病毒可能最終達到神經毒力的穩定階段，即被“固定”，就像巴斯德將狂犬病毒在兔腦中連續傳播後所發生的一樣，其中固定病毒對犬的致病性較小。 

最終，泰勒在小鼠中傳代法國毒株超過100代，產生了一種“固定”病毒，接種和動物死亡之間的間隔為4天。這項工作為疫苗奠定了基礎。

黃熱病的嗜神經性和嗜內臟性被認為具有獨特的病毒特性。泰勒觀察到，如果將黃熱病病毒經腦內途徑接種恆河猴後，猴子死於肝炎，而非腦炎。相反，通過小鼠腦內傳代固定了嗜神經性的病毒，則已經喪失了在猴子中產生肝炎的能力。

泰勒的發現，加上受到黃熱病健康威脅的患病人羣眾多，以及實驗室研究人員接二連三感染黃熱病的刺激，促使科學家們下定決心，要開發一種基於通過小鼠腦中連續傳代的減毒活疫苗。

第七步 毒力減不夠，免疫血清來補充

洛克菲勒研究小組的第一個黃熱病疫苗是利用泰勒在小鼠中傳代獲得的“固定病毒”以及人類血清製造的。

這個的病毒株已經經小鼠大腦傳代多達176次，而人類免疫血清則是為了保護人類免於減弱的病毒減毒不足而添加的。他們的方法非常細緻，可以説是代表了當時活疫苗開發的最安全方法。

初步研究表明，疫苗和血清沒有產生不良反應，並且產生了明確的免疫力。1931年，洛克菲勒大學的科學家在研究所的研究醫院對住院病人進行了人類接種。沒有觀察到明顯的不良反應。輕度不良事件包括局部壓痛和充血，發燒和關節痛，是由於疫苗的腦組織成分引起的，而不是由黃熱病病毒感染引起的。

隨後，用小鼠腦病毒進行血清疫苗接種成為實驗室工作人員免疫的標準方法，這些實驗室工作人員感染黃熱病的風險很高。到1934年，紐約，巴西，哥倫比亞和阿根廷已有56人接受了接種；倫敦惠康科學研究所進行了類似的研究。

但是，人體免疫血清的需求遇到了短缺的問題。嘗試使用動物抗血清替代人血清的嘗試引起了對反應原性、外來的動物病原體和成本的擔憂。此外，在標準化條件和在疫苗製備中控制病毒-血清混合物的體外中和的技術的困難也是其廣泛使用的主要障礙。

洛克菲勒小組認為這種嗜神經性病毒作為獨立疫苗過於危險，因此採取了另一種方法，開始尋找致病性較低的病毒株，並尋求改進的疫苗製造方法。

第八步  如果不用免疫血清，難道就不行嗎

哈佛大學的Sellards和突尼斯巴斯德研究所的Laigret於1932年率先使用不含免疫血清的法國病毒株接種人類，使用的是使用感染了經過傳代134代的神經適應性法國病毒株的10％小鼠腦懸浮液。其中一些人出現了嚴重的副作用，包括噁心，嘔吐，腹痛，活動過度，反射異常，咯血和蛋白尿。

Laigret認為，減毒不充分的嗜神經性病毒是造成這種情況的原因，因此他重新努力通過改變配方和降低劑量來開發一種更為安全的疫苗開發方案。

其中有一種方案是從巴斯德最初的狂犬病疫苗方法中借用的，就是先接種病毒在小鼠大腦中培養4天的“老病毒”，然後以20天的間隔分別再給予培養2天和1天的病毒。

還有一種方法是利用低温減毒，將病毒在20℃下“減毒”24小時並且使用蛋黃或者橄欖油包被。後者被認為可以減慢病毒從接種部位的擴散。

因此，在7年的時間裏，儘管未經對照的臨牀試驗，但嗜神經疫苗已從最初的人體試驗過渡到大規模的試驗。到1939年，西非已有20,000多人接受了上述兩種疫苗接種方案之一。

隨着更多人接種疫苗，最初對安全性和耐受性的擔憂基本得以消除。但是，令人擔憂的是儘管沒有進行仔細的隨訪研究，但有中樞神經系統嚴重反應的報告出現。

第九步 換一種培養方法，換一種病毒毒株

索耶、泰勒和洛克菲勒基金會的其他科學家認為法國的疫苗嗜神經性風險太高，需要一種新的方法來減輕嗜神經病毒的危險。為此，泰勒及其同事利用了一種新開發的體外培養技術。

在1932年，泰勒證明了嗜神經性法國病毒也可以在雞胚組織培養物中繁殖，但是嘗試培育未經改變的原始法國病毒株卻失敗了。

於是，他們開始採用Asibi病毒株代替了法國病毒進行研究。

1936年，Asibi病毒株首次成功地進行了體外培養。經過240次傳代後，儘管命名為17E的病毒在腦內接種後仍保留了產生腦炎的能力，但對恆河猴失去了嗜內臟性。

17E病毒被認為尚未充分減毒，殘留的神經毒力使其仍然需要同時使用免疫血清，因此只是在實驗室工作人員的血清免疫接種方案中替代了原有的嗜神經的病毒。

第十步 去除嗜神經性，17D疫苗得以問世

在初次繁殖時使用的切碎的整個小鼠胚胎中存在的神經組織負責維持培養的病毒的嗜神經性，促使泰勒在進行連續的病毒傳代之前從培養基上除去大腦和脊髓組織。

最重要的實驗傳代病毒株-命名為17D-使用已在完整小鼠胚胎中傳代培養18次的病毒，隨後在完整切碎的雞胚培養物中傳代了58次，此後該病毒在去除了神經組織的切碎的雞胚中傳代。

通過小鼠的腦內接種測試了後一個子代的每一個的嗜神經性。休·史密斯（1902-1995）負責17D血統實驗的監督。

休·史密斯不但協助泰勒開發了17D疫苗，還對其在巴西的臨牀研究和應用功不可沒

在去除神經組織的雛雞胚胎中連續傳100次傳代後（即開始體外培養後第176傳代），史密斯觀察到攻擊的小鼠不再進展成致死性麻痹。在恆河猴中，該病毒的嗜內臟毒性也明顯減弱，皮下接種後既不引起明顯的病毒血症，也不引起肝炎。

進一步確定，在繼代培養物第89和114代之間發生了猴子神經毒性的喪失，在第114和176代之間減弱了小鼠的神經毒性。

接種減毒病毒的猴子產生了中和抗體，並抵抗了野生型Asibi病毒的致死性攻擊。體外和臨牀前數據表明，可以在不添加保護性免疫血清的情況下，將17D病毒作為人疫苗安全地進行測試。

第十一步  小規模臨牀研究：安全比有效更重要

遵循早期關於傳染病研究的悠久傳統，17D疫苗最初接種的兩個人類受試者是泰勒和史密斯，他們都是低風險的人，因為他們都具有免疫力：泰勒是在1929年在哈佛期間因偶然的實驗室感染而致病，而史密斯通過接種法國嗜神經病毒和免疫山羊血清獲得免疫力。

在成功為另外兩個免疫對象接種疫苗後，對五個非免疫個體給予了高劑量的減毒病毒。儘管出現了少量發熱反應，但該產品耐受性良好，所有受試者的血清保護性中和抗體水平均升高。

泰勒和史密斯在黃熱病疫苗研究中已達到關鍵的里程碑。

第十二步 大規模臨牀應用

在紐約進行的17D初步臨牀測試獲得了令人滿意的結果，隨後它迅速轉變為在黃熱病威脅公眾健康的國家-巴西使用。

在1937年1月到達里約熱內盧的1個月內，史密斯開始了小規模的人體試驗。他首次在24位未感染的對照工作者中證明了17D疫苗的耐受性和免疫原性，儘管在大約一半的受試者中記錄了短暫病毒血症。

隨後，他與Henrique de Azavedo Penna一起在當地的黃熱病實驗室建立了疫苗生產能力，並進行了額外的對照組免疫，並在6個月內擴大了疫苗的現場試驗範圍。

選定的疫苗評估地點位於巴西東南部Mineas Gerais州的Varginha，那裏的咖啡種植園工人黃熱病高發。到1937年8月，已有2,800多名受試者接種了疫苗，沒有明顯的不良反應。到年底，已有38,077人接種了17D疫苗。

該疫苗似乎是安全且具有免疫原性的，超過95％的受測受試者會產生中和抗體反應。在此期間，使用雞蛋生產疫苗的方法得到了改進。在里約熱內盧的奧斯瓦爾多·克魯茲基金會實驗室擴大了生產規模，使用了17D疫苗來阻斷疫情。

到1938年底，將近100萬巴西人已經接種了17D疫苗。一年後，開始了本地生產相對便宜的疫苗的工作，包括疫苗，疫苗接種用具和現場使用所需的複雜冷鏈，估計每劑製造成本僅為當時的 10美分。

儘管從未以受控方式進行正式測試，但根據多年的經驗，人們接受了17D黃熱病疫苗的療效。

非人類靈長類動物的大量臨牀前數據表明，它具有抗野生型病毒致死性攻擊的保護活性。人17D免疫後，會迅速出現中和抗體，其中基於17D疫苗的中和抗體應答在美國接種疫苗的成年人中的有效率為99％，在秘魯接種疫苗的嬰兒中則超過95％。

流行病學觀察同樣證明了疫苗的有效性。黃熱病的實驗室感染在常規免疫之前很普遍，但此後消失。此外，超過50年的觀察表明，南美國家的叢林黃熱病僅發生在未免疫的人中，暴發期間的免疫應急接種可以使得病例迅速消失。

我國生產的黃熱減毒活疫苗也是使用17D病毒株

黃熱病17D疫苗長期以來被認為是最安全的活疫苗之一。神經性不良事件很少發生， 1960年終止對6個月以下嬰兒的免疫接種後，安全性得到了進一步改善。

一種穿越了疫苗不同時代才得以成功開發的疫苗

1951年，洛克菲勒基金會的科學家馬克斯·泰勒成為唯一因病毒疫苗的開發而獲得諾貝爾生理學或醫學獎的人。他的黃熱病17D減毒活疫苗並不是第一個在人類中進行測試的黃熱病疫苗，但它是迄今為止最成功的黃熱病疫苗。自20世紀30年代後期問世以來，已經分發了超過5億劑。

泰勒是歷史上唯一一位因為成功開發病毒疫苗而獲得諾獎的科學家

黃熱病疫苗開發的故事之所以引人注目，部分原因是它跨越了疫苗歷史的多個時代。

它的起源始於19世紀末，恰逢由微生物學和免疫學的啓示驅動的疫苗接種概念迅速發展的時期。而疫苗真正成功的20世紀30年代，又處於病毒學出現的早期。在這個前分子時代，病毒基因型在不同宿主中傳遞時的基因型變化只能通過遵循生物學特性（如毒力）來間接研究。

儘管嘗試重現導致17D內臟和神經嗜性減弱的傳代過程，但泰勒無法解釋原始傳代89到176代之間發生的變化。通常，連續傳代的病毒衰減導致生物學表型的變化非常不可預測。

17D疫苗開發的成功歸因於系統、細緻的應用經驗以及有準備的頭腦進行的敏鋭而持續的觀察。當然，成功也離不開幸運。

由於黃熱病對醫療和公共衞生的影響，公眾和科學界被迫採取潛在的預防措施，其中一些措施被證明無效或危險。

在此過程中，吸取了許多經驗教訓，這些經驗教訓已成為疫苗開發和評估常規的一部分：可控安全性評估的重要性；定量效能測定；熱穩定性評估；生產過程中病毒傳代的標準化和控制；神經毒性和內臟毒性的敏感標誌物；控制病毒變異；以及監測罕見的不良事件。

新冠疫苗能夠用減毒活疫苗技術開發嗎？

包括黃熱病17D疫苗在內，歷史上有好幾種非常成功的人類減毒活疫苗。它們都是基於實際病原體的減毒株，其毒力基因通過體外傳代而喪失或突變。由於病毒在被接種的個體中複製，因此免疫應答很可能通過抗體和細胞免疫應答靶向結構性和非結構性病毒蛋白。

如果通過傳統方法進行開發，就像黃熱病17D那樣，這將非常耗時，沒有十幾年的時間根本不可能獲得成功。如果使用反向遺傳學進行開發，比如通過合理修飾病毒（例如通過密碼子去優化或刪除功能基因）來實現衰減抵抗先天免疫識別，開發速度會快得多，但在技術上將具有挑戰性。

同時需要特別指出的是，要產生一種用作疫苗的病原體減毒株，就需要證明其無法通過基因還原而變成病原體。在冠狀病毒的情況下，這尤其具有挑戰性。因為已知它們會在自然界中重組，並且從理論上講，減毒的疫苗株可與野生型冠狀病毒重組以重建致病株。

目前只有三種減毒活疫苗處於臨牀前開發階段，所有這些都通過密碼子去最優化而減毒。而最終能否獲得成功，還需要我們耐心等待。

參考文獻

Monath TP (2010) Yellow Fever In:Artenstein A(ed) Vaccines: A Biography. Springer, New York

Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines in development.  Nature 586, 516–527 (2020). 

Jeyanathan, M., Afkhami, S., Smaill, F. et al. Immunological considerations for COVID-19 vaccine strategies. Nat Rev Immunol 20, 615–632 (2020). 

http://en.wikipedia.org/wiki/Yellow_fever_vaccine