交配可以啓動穩定的 RNA 沉默，克服表觀遺傳恢復 3_風聞

轉基因的命名

字母T用於指定所有遺傳雜交中的轉基因oxSi487。oxSi487的活性或表達等位基因命名為T，oxSi487的非活性或沉默等位基因在親本中命名為iT。額外包含隱性標記（dpy或dpy unc）的基因型為藍色或粉紅色字體。有關所用隱性突變的詳細信息，請參見補充圖 3，瞭解T和“遺傳雜交”的所有變體。

餵食 RNAi 並評分相關缺陷RNAi 實驗是在 20 °C 的線蟲生長培養基板上進行的，該培養基補充有 1 mM IPTG（Omega Bio-Tek）和 25 µg/ml 羧苄青黴素（MP Biochemicals）（RNAi 板）。在所有情況下，基因型和年齡匹配的動物都被餵食對照 RNAi (L4440)，並作為對照一起評分。

單代（P0 餵養 RNAi）該測定如先前所述進行15並用於除圖6c之外的所有帶有餵食 RNAi 的圖中 （參見下面的“多代”）。簡而言之，L4 動物被餵食針對靶基因的 dsRNA 24 小時。一些 P0 動物對錶達進行評分，而其餘動物在 M9 緩衝液中洗滌四次，然後在未接種的平板上爬行一個小時以去除殘留的 RNAi 食物。然後將動物單獨放置在 OP50 上，每 3-4 天對 6-12 只 L4 動物進行盲傳，以防止飢餓並跟蹤餵養後的世代。通過成像對每一代 L4 動物進行評分，並對 L4 兄弟姐妹進行傳代以獲得下一代的後代。在補充圖8d 中執行的饋送中  和圖 6b，F2 動物通過眼睛評分。

多代（P0-F2 餵養 RNAi）多代動物 (P0-F2) 接受了 RNAi 的餵養。F1 和 F2 動物在 L4 階段進行評分以評估 RNAi 食物的效力，並將 L4 階段的兄弟姐妹轉移到帶有 RNAi 食物的新盤中以防止飢餓。與 P0 餵養 RNAi 協議類似，成人（L4 後 24 小時）用 M9 緩衝液洗滌四次以去除殘留的 dsRNA，並轉移到含有 OP50 的板上。然後對未處理的後代的遺傳沉默效應進行評分。該測定用於圖 6c。

雙鏈RNA的表達為了研究遺傳沉默，我們從有絲分裂不穩定的染色體外陣列中表達了 dsRNA。表達數組的動物將有繼承數組的後代和不繼承數組的後代。我們使用了來自jamEx140 [Prgef-1::gfp-dsRNA::unc-54 3 ’ UTR和Pmyo-2::DsRed::unc-54 3 ’ *UTR]*47 的在神經元中表達 dsRNA 和在咽部中表達 DsRed 的陣列。評估缺乏陣列的後代以測量遺傳沉默，因為父母暴露於來自陣列的 dsRNA 但後代沒有。該測定用於補充圖 8h。

使用尼康 AZ100 顯微鏡成像的蠕蟲階段除了 P0 RNAi 餵養的動物和表達oma-1::gfp或Ppie-1::gfp::PH 的動物外，在所有餵養 RNAi 實驗中對 L4 階段動物成像後對 mCherry 或 GFP 的熒光強度進行評分（圖 6a和補充圖 8a-f)。mCherry 或 GFP 的熒光強度在成像 L4 階段的動物後評分 圖1A，C-E ，圖2a，b和d-G ，圖3a，C，4B，C（通過精子信號），d-克，5，6和補充圖。 1c–k、2a、b、3c、4a、5a–i、l、n–p, 6d, e , 7a–k , 8a – h (P0 動物除外)。mCherry 或 GFP 的熒光強度在 L4 階段後 24 小時僅在圖 6a 、d中表示的P0 動物和圖6 中表示的動物中進行評分 。 1和E，圖2a（*MUT-16（ - ）*動物）中，g，圖4b，C（通過卵母細胞信號），圖6B（P0和F2），補充圖。 1a、i、5g、i、m、6d、7b、c（F2 到 F5）、h 和 i。在圖4e和補充圖 7c 中表示的 L4 階段後 48 小時，對 mCherry 或 GFP 的熒光強度進行評分  （僅限 F1）。

基因雜交三個 L4 雌雄同體和 7-13 只雄性被放置在同一塊板上，並允許在每個交叉板上交配。在交叉板建立後 3-5 天分析交叉後代。每個雜交至少建立兩個獨立的交配。對於圖4f 中的十字架 （僅限 F1s），補充圖。 5a、c（僅與Mos1/+雜交）、h、m、n、7c（僅 F1s），在對所有動物進行評分後，通過 PCR（引物 P1、P2 和 P3）確定所需的基因型，並且僅來自動物的數據用正確的基因型作圖。在無花果。 1c-e、2a、b、g、3c、4b-d、5b和補充圖。 1c, d, j, k, 2a , 5a, d–g , 6d, e , 7a, b, d–i , dpy-2(e8) (~3 cM from oxSi487 ) 被用作鏈接標記或平衡器來確定T的基因型。在無花果。 1e、2a、f、3a、4e、f、5b和補充圖。 1f–h , 3d , 5a–d , i, o, p , 7c, j, k , dpy-10(-) (~7 cM from oxSi487 ) 用作鏈接標記或平衡器來確定T的基因型. 在補充圖中。 圖 2a、5d、e、h、unc-8(e49) dpy-20(e1282)用作連鎖標記或平衡器來確定ax2053的基因型。在補充圖 5a 中，unc-4(e120)（來自oxSi487 的~1.5 cM ）被用作連接標記或平衡器來確定T的基因型。在圖 2a右側（rde-1(-) 的對照）中，dpy-17(e164) unc-32(e189)用作標記以促進雜交後代的鑑定。一些雜交還需要通過對單個蠕蟲進行基因分型來鑑定雜交後代，包括圖 1 和圖 2 中的那些。 2b, 克, 3c (對於ego-1(-) rrf-1(-) ), 4d , 補充圖。 5a、c（僅Mos1/+）、h、l、6d、e、7c、f、g。與T雜交的動物*；PRG-1（+/-）雄性在圖 2b中頂部或3 c同樣也基因分型以確定T / + *; prg-1(-/-)或T; prg-1(−/−)分別交叉後代。在補充圖中的十字架中。 5f, h , 7f，i（對照雜交），所需基因型的雜交後代分別通過咽部 mCherry 或 GFP 47的不存在或存在來鑑定。對起始（圖2）和維持（圖 3）要求進行分析的所有菌株 至少已突變兩代，除了在起始時測試對prg-1(-)的要求時，這是使用prg-1( - ）的是分別為突變體用於一次生成或動物自我-1（ - ）中的維護，其使用進行自我-1（+ /-*）*的父母。

與 mut-16 突變體的遺傳雜交以測試交配誘導沉默的啓動在圖 2a 中，L4 雄性雜交後代僅對 mCherry 熒光進行評分，因為由於腸道自發熒光，在 L4 雄性生殖系的單個性腺臂中難以評估 GFP 熒光。

遺傳雜交以確定在重新引入野生型 hrde-1 後是否會失去去除野生型 hrde-1 後的表達恢復在補充圖 6e 中，hrde-1(-)突變雄性與保持沉默約 270 代的iT雌雄同體交配，導致雜交後代 (F1) 可以產生不同基因型 (F2) 的自體後代，其中T純合子和野生型或hrde-1突變等位基因的純合動物通過傳代自體後代（F3 到 F7）進行評估。另外，每一代hrde-1(-)；Ť通過自體受精（F2至F6）中產生雌雄同體交配被用野生型（+ / +）或HRDE-1（ - ）男性檢查重新啓動跨代沉默的可能性。mCherry 和 GFP 熒光在雜合 F1 雜交後代 ( hrde-1(-/+) ) 和 F3 或所描述基因型的後續後代中進行評分。F2 hrde-1(-)的雜交後代（灰色文本）；**Ť儘管多種生物學重複由於實驗設計不能得到與野生型雄性交配雌雄同體。具體來説，交配是在單個hrde-1(-)之間重複設置的；**牛逼雌雄同體有三個野生型男性在每一代人，從F2代開始起。hrde-1(-)的雌雄同體的選擇；**T基因型僅從 F3 代成功，因為純合子hrde-1(-); T只能從F2代開始建立，這是後代基因型可以成為hrde-1(-)的第一代*；T後交叉設於 P0。結果，F2 hrde-1(-); Ť需要有雌雄同體雜交為，但它們不能從它們的區別HRDE-1（+）; Ť或HRDE-1（+ /-**）;F1 > F2 板上的T兄弟姐妹。確定所用雌雄同體基因型的唯一方法是首先將未知hrde-1*的單個隨機雌雄同體交配基因型與三個野生型雄性，然後允許 F3 後代在犧牲 F2 雌雄同體進行基因分型之前放置 3 天。然而，此時，F2 雌雄同體的受精囊中將含有野生型精子，這可能會混淆基因分型 PCR。

使用過表達 gpr-1 的動物進行遺傳雜交為了分析DNA無關的信號，我們使用了最近開發的工具，其防止父系和從受精卵內熔化母體前核19，20。AG 蛋白調節劑 GPR-1 在母系過度表達時，會增加拉動紡錘體極的力，並防止母本和父本細胞核融合。這使得父系細胞核的內容只能遺傳到 P 譜系的細胞中，而母體細胞核的內容只能遺傳到 AB 譜系的細胞中。通過大多數交叉後代中的這種非孟德爾分離，父本 DNA 遺傳到所有生殖細胞和選擇體細胞（如腸和體壁肌肉），而母本 DNA 僅遺傳到體細胞中（圖 2d））。一小部分後代要麼在生殖系和一些體細胞中具有母本 DNA，在大多數體細胞中具有父本 DNA（圖 2d），要麼在所有細胞中與父本和母本 DNA 進行孟德爾分離（數據未顯示）。為了分析該工具在我們手中的穩健性，我們使用gtbp-1::gfp測試了父本和母本 DNA 的分離，其在所有組織中表達細胞質 GFP（圖 2d）。當過度表達gpr-1 ( gpr-1 oe ) 的雌雄同體與攜帶gtbp-1::gfp 的雄性雜交時, > 95% 的雜交後代表現出非孟德爾分離，父系 DNA 遺傳到 P 譜系細胞（基於生殖系中存在 GFP）和母體 DNA 遺傳到 AB 譜系細胞（基於某些咽部不存在 GFP細胞和神經元）。數量少得多的雜交後代 (<5%) 表現出反向分離模式或孟德爾分離模式。我們使用gtbp-1::gfp作為標記來識別與gpr-1 oe進一步雜交的非孟德爾雜交後代。為了分析親本信號對生殖系中T 的影響，我們必須確保T（以及伴隨的標記基因，gtbp-1::gfp) 總是從男性遺傳，因為大多數非孟德爾雜交後代會將父系 DNA 遺傳到生殖系中。由於表達gpr-1的轉基因也表達了gfp的同義變體，我們使用了T的變體，即T∆∆∆或Tcherry進行進一步分析，以避免來自兩個不同來源的 GFP 熒光，混淆解釋。

與Pmex-5::Tcherry::mex-5 3’utr和Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3’utr 的遺傳雜交MosSCI將Pmex-5::Tcherry::mex-5 3 ’ utr和Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3 ’ utr整合到基因組中導致轉基因的自發沉默22，其表達可以恢復通過hrde-1的突變。因為親本hrde-1是可有可無的，合子hrde-1足以啓動交配誘導的沉默（圖 2b），我們使用Pmex-5::Tcherry::mex-5 3 ’ utr；hrde-1(-)或Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3 ’ utr; hrde-1(-)相互交叉的親本動物以測試交配誘導的沉默（補充圖 1i）。這些雜交產生了基因型Pmex-5::Tcherry::mex-5 3 ’ utr 的雜交後代*；hrde-1(+/-)或Pmex-5::Tcherry::tbb-2 3 ′ *utr; HRDE-1（+ /- ）*，*分別，然後將其計分配合誘導的沉默。

iT和iTΔ菌株的生成和維持為了使具有與dpy標記相連的iT 的雌雄同體，AMJ581 雌雄同體與 N2 雄性交配以產生雜交後代雄性，它們都顯示來自oxSi487 的明亮 mCherry 熒光。然後將這些雄性與 N2 雌雄同體交配以產生具有無法檢測到的 mCherry 熒光的雜交後代 (F1)。F1 動物被允許產生oxSi487純合子的後代 (F2)，這由連鎖dpy-2(e8)突變的純合性確定。一種這樣的 F2 動物被分離出來作為iT菌株 (AMJ692)進行繁殖。

為了製造具有iT 的雄性，dpy-17(e164) unc-32(e189)雌雄同體與 EG6787 雄性交配以產生具有不可檢測的 mCherry 熒光的雜交後代 (F1) 雌雄同體。允許這些雜交後代具有與oxSi487純合的自身後代(F2) 。兩個這樣的 F2 被分離出來作為兩個不同的iT系進行傳播。其中之一被指定為 AMJ724 並用於進一步的實驗。這些菌株保持oxSi487的沉默，並進行熱休克以產生雄性。使用 PCR 驗證iT菌株的基因型。

為了使iT∆連接到dpy標記的雌雄同體，AMJ767 雌雄同體與 N2 雄性交配以產生具有明亮 mCherry 熒光的雜交後代雄性。然後將這些雄性與 GE1708 雌雄同體交配以產生具有無法檢測到的 mCherry 熒光的雜交後代 (F1)。F1允許動物給予純合的後代TΔ通過基因分型確定jamSi20。分離出一個純合子代作為iTΔ菌株 (AMJ917)進行繁殖。使用 PCR 驗證iTΔ菌株的基因型。

AMJ692 被用來測試基因表達的恢復，大約 150 代。這一代時間估計如下：在 556 天的時間裏，蠕蟲每 3.5 天傳代一次，共傳代 143 代，除了允許它們飢餓的三個間隔和飢餓後恢復幼蟲的間隔。這些從飢餓中恢復的間隔在 49 天內總共跨越了約 6 代。因此，總代數 = 143 + ~6 = ~150 代。其他iT菌株 AMJ724、AMJ552 和 AMJ844的世代時間也進行了類似的估計。沉默超過 150 代的iT菌株用於測試維持跨代沉默對 RNAi 因子的要求。

CRISPR-Cas9 介導的oxSi487編輯為了在oxSi487 中生成編輯，基於 Cas9 的基因組編輯與共轉換策略62被使用。使用補充表 5 中列出的引物從 pYC13 擴增嚮導 RNA。純化擴增的嚮導（PCR 純化試劑盒，Qiagen）並在體外測試切割效率（Cas9，新英格蘭生物實驗室目錄號 M0386S）。對於大多數編輯，修復的同源模板（修復模板）是使用 Phusion 高保真聚合酶（新英格蘭生物實驗室目錄號 M0530S）和基因特異性引物從 gDNA 製成的，以分別擴增待編輯位點上游和下游的區域。將兩種 PCR 產物用作模板以使用 Phusion 高保真聚合酶生成整個修復模板，並使用 NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up（Macherey-Nagel，目錄號 740609.250）純化融合產物。同源模板生成T∆∆和dpy-10(-)是單鏈 DNA 寡核苷酸。向野生型動物注射 0.12–12.9 pmol/µl 嚮導 RNA、0.08–1.53 pmol/µl 同源修復模板以在T和dpy-10和 1.6 pmol/µl Cas9 蛋白（PNA Bio 目錄編號）中進行編輯.CP01）。在T∆∆編輯的動物中，由於 EG6787背景中的unc-119(ed3)突變，Punc-119缺失導致 Unc 動物，這表明功能性轉錄本不是由拯救Punc-119的剩餘部分製成的*::unc-119::unc-119 3* ’ utr插入到ttTi5605. 使用 PCR 和 Sanger 測序驗證編輯。有關特定試劑的其他詳細信息，請參閲補充表 5。

CRISPR-Cas9 介導的插入為了生成大插入，基於 Cas9 的編輯協議改編自參考文獻。63 . 將以下混合物注射到 HT1593 動物中：42–55 ng/µl 質粒，表達 Cas9 蛋白和 sgRNA 序列，該序列特異於ttTi5605(pDD122)附近的染色體 II 位點或ttTi4348 (pSD18)附近的染色體 I 位點，105 ng/µl 的 pMA122 ( Phsp -16.41::peel-1::tbb-2utr ), 42–55 ng/µl 修復質粒，用於插入Tcherry**Crispr ( jamSi38, jamSi40, jamSi41 ) 或Tcherry I ( jamSi56 )）。注射後，將動物挑出並讓平板擁擠直至飢餓。飢餓的平板在 34°C 下熱休克 2.5-4 小時，讓熱休克動物過夜恢復。在熱休克中倖存下來的非 Unc 動物被挑選出來，繁殖並使用 PCR 篩選編輯。然後在提取基因組 DNA 後篩選出編輯陽性的分離株中驗證單拷貝插入。

Mos 介導的單拷貝插入 (MosSCI)為了生成大插入，MosSCI 協議改編自參考文獻。11 . 將以下混合物注射到 EG4322 動物中：50–55 ng/µl 表達 Mos1 轉座酶的質粒（pCFJ601：Peft-3::mos1 轉座酶::tbb-2utr），105 ng/µl pMA122（Phsp-16.41::peel- 1::tbb-2utr )，50–55 ng/µl 修復質粒，用於將Tcherry、Tgfp、TcherryΔpi、Tcherry::tbb-2 3 ’ utr或Tcherry::mex-5 3 ’ utr插入染色體 II ttTi5605附近插入部位。注射後，將動物挑出並讓平板擁擠直至飢餓。飢餓的平板在 34°C 下熱休克 2.5-4 小時，讓熱休克動物過夜恢復。在熱休克中倖存下來的非 Unc 動物被挑選出來，繁殖並使用 PCR 篩選編輯。然後在提取基因組 DNA 後篩選出編輯陽性的分離株中驗證單拷貝插入。

定量 RT-PCR (RT-qPCR)使用 TRIzol (Fisher Scientific) 從 50 至 100 µl 混合階段動物顆粒中分離總 RNA。通過從相同菌株的三個不同平板中造粒動物來分離三個生物學重複。用氯仿抽提RNA，用異丙醇沉澱，用乙醇洗滌並重懸於20-30 µl 無核酸酶水中。留出 2–5 µl 重懸的 RNA 以在凝膠上運行，剩餘的在 DNase 緩衝液（100 mM Tris-HCl，pH 8.5、5 mM CaCl 2、25 mM MgCl 2)，並與 0.25 µl DNase I（新英格蘭生物實驗室，2 單位/µl）在 37 °C 下孵育 60 分鐘，然後在 75 °C 下加熱滅活 10 分鐘。在 1% 瓊脂糖凝膠上運行 DNase 前和後處理的 RNA，以檢查是否存在 rRNA 條帶。測量 RNA 濃度，並使用 SuperScript III 逆轉錄酶（Invitrogen 目錄號 18080044）將等量（500–5000 ng）的 RNA 轉化為 cDNA，與製造商的建議相比，數量減少了兩倍。對於 cDNA 轉化，每個樣品的每個生物學重複進行 3-5 次技術重複，RT 引物 P82 用於R11A8.1，P176用於tbb-2前體 mRNA，P177用於 tbb-2 mRNA，P83用於mCherry前體用於mCherry 的mRNA P84基因，P78的GFP前體mRNA和P85的GFP表達。使用 cDNA 作為模板並根據製造商的建議使用 LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix（羅氏目錄號 4707516001）指南進行 PCR。對於pre-mRNA的分析，引物P86和P87用於R11A8.1，P88和P89用於tbb-2，P93和P179用於mCherry，P96和P97用於gfp。對於 mRNA 的分析，引物 P94 和 P95 用於tbb-2，P90 和 P91 用於mCherry，P98 和 P99 用於gfp。使用 2 -Ct計算倍數變化 值和樣品被歸一化為總 RNA。

通常測量三個（補充圖 2c）到六個（補充圖 6c）獨立的生物重複，每個生物重複是三到五個技術重複的中位數。縮放散點圖用於描述每個生物複製的前 mRNA 和 mRNA 的相對丰度。RNA 丰度被估計為與 2 -Ct成正比，並且目標轉錄物被標準化為總 RNA 以獲得相對丰度。

染色質免疫沉澱-qPCR (ChIP-qPCR)該協議改編自參考文獻。64每個 ChIP 實驗使用 300–500 μl 冷凍混合階段蠕蟲顆粒。每個菌株進行三個生物學重複，每個樣品中的蠕蟲被分成 100 µl 顆粒。通過用研缽和研杵研磨來粉碎冷凍顆粒。將粉碎的沉澱物重新懸浮在 1 ml 緩衝液 A（15 mM HEPES-Na，pH 7.5、60 mM KCl、15 mM NaCl、0.15 mM β-巰基乙醇（CALBIOCHEM 目錄號 444203）、0.15 mM 精胺（Sigma-Aldrich 目錄號S3256-1G)、0.15 mM 亞精胺（Sigma-Aldrich 目錄號 S2626-1G）、0.34 M 蔗糖、1X HALT 蛋白酶（ThermoScientific 目錄號 78440）和磷酸酶抑制劑混合物（ThermoScientific 目錄號））。為了交聯，添加甲醛至終濃度為 2%，並在室温下孵育 15 分鐘。通過添加 0.1 ml 1 M Tris HCl (pH 8. 0）。裂解液以 15,000 × g在 4°C 下保持 1 分鐘。通過在洗滌之間離心，用冰冷的緩衝液A洗滌所得沉澱物兩次。將沉澱物重新懸浮在含有 2 mM CaCl 2 的0.3 ml 緩衝液 A 中。加入微球菌核酸酶（Roche 目錄號 M0247S）至終濃度為 0.3 U/μl，並在 37°C 下孵育 5 分鐘（每分鐘將管倒轉數次）。加入終濃度為 20 mM 的 EGTA 以停止消化反應，並將樣品以 15,000 × g離心 在 4 °C 下 1 分鐘，然後用 300 µl 冰冷的 RIPA 緩衝液（1X PBS、1% NP40（光譜目錄號 T1279）、0.5% 脱氧膽酸鈉（Sigma-Aldrich 目錄號 D6750）洗滌所得沉澱-10G)、0.1% SDS、1X HALT 蛋白酶和磷酸酶抑制劑以及 2 mM EGTA（Sigma-Aldrich 目錄號 E3889-10G））。樣品在 4 °C 下以 15,000 × g離心 1 分鐘。在 0.8 ml 冰冷的 RIPA 緩衝液中洗滌後重新懸浮沉澱，並使用 Covaris 65剪切溶解。除了剪切期間，樣品一直保持在冰上。將每個生物複製的所有剪切裂解物合併並均分以沉澱所有被測量的染色質標記。剪切裂解物以 15,000 × g離心 2 分鐘。將 80 μl 上清液在 -20 °C 下留作“輸入”文庫，剩餘的上清液用於 IP。抗體是根據它們在秀麗隱杆線蟲66 中的效率來選擇的. 2 μg 抗 H3 抗體（Abcam，ab1791）、3 μg 抗 H3K9me1 抗體（Abcam，ab8896）、3 μg 抗 H3K9me2 抗體（Abcam，ab1220）或 2 μg 抗 H3K9me3 抗體（Abcam）之一, ab8898) 加入並在 4 °C 下輕輕攪拌過夜。添加 50 μl 蛋白 A Dynabeads（1x PBS 緩衝液中的 10% 漿液）並通過在 4°C 下振盪 2 小時來混合。然後用冰冷的 600 μl LiCl 洗滌緩衝液（100 mM Tris HCl，pH 8、500 mM LiCl、1% NP-40、1% 脱氧膽酸鈉）將珠洗滌四次（4 分鐘/洗滌）。使用磁性支架（DynaMag-2 Magnet，Thermo Scientific）對珠子進行沉澱，每次洗滌後棄去上清液。珠子和輸入物與 450 μl 蠕蟲裂解緩衝液（0.1 M Tris HCl，pH 8，100 mM NaCl，含有 200 μg/ml 蛋白酶 K 的 1% SDS）在 65 °C 下持續 4 小時，每 30 分鐘攪拌一次，以洗脱免疫沉澱的核小體和反向交聯。通過有機提取和沉澱分離DNA。根據製造商的建議，使用 LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix 通過 qPCR 測量獲得的 DNA（有關詳細信息，請參閲 qRT-PCR 方法的 PCR 部分和前 mRNA，或等效的 DNA，引物）R11A8.1、mCherry和gfp）。使用 2 -ΔΔCt方法計算倍數變化，並將樣品標準化為免疫共沉澱對照基因R11A8.1。

單分子熒光原位雜交 (smFISH)定製的 Stellaris FISH 探針僅針對來自oxSi487的mCherry和gfp序列的外顯子設計，使用來自 Biosearch Technologies 的基於網絡的 Stellaris FISH 探針設計器 ( www.biosearchtech.com/stellarisdesigner )。避免了預期跨越外顯子-外顯子連接的任何探針設計，以允許對成熟和新生轉錄物的等效檢測。標準線蟲smFISH 協議後跟 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染色如所述使用67 , 68。用於檢測mCherry的探針混合物包括 25 個外顯子特異性探針（P112 到 P136），每個探針都用 Quasar 670 染料和反義標記mCherryRNA。用於檢測gfp的探針混合物包括 26 個外顯子特異性探針（P137 到 P162），每個探針都用 Quasar 670 染料和gfp RNA反義標記。調整後的 smFISH 方案如下：50-100 只 L4 動物或成年動物在 L4 後~24 小時（圖 3b，補充圖 2e、4b、6a）在 400 µl 1X 磷酸鹽緩衝鹽水 0.1% Tween-20（ PBST，Amresco，目錄號 C999G23 K875-500ML）含有 0.25 mM 左旋咪唑，用於解剖或小於 L4 的整個動物（補充圖 4b）) 在 1X PBST 中洗滌並在室温下固定在 1X PBST 上的 1ml 固定溶液（3.7% 甲醛（Amresco，目錄號 0493-500 ML）在 1X PBST 中）中。不同試驗的固定時間介於 15 到 45 分鐘之間。樣品在 1X PBST 中洗滌，在透化溶液中孵育 10 分鐘（0.1% Triton X-100 在 1 ml 1X Gibco PBS pH 7.4（Thermofisher Scientific，目錄號 10010023）中），在 PBST 中洗滌兩次並重懸於 1 ml 70 % 乙醇並在 4°C 下孵育 1 至 7 天。然後平衡固定的動物並用洗滌緩衝液（2X 檸檬酸鈉（SSC，Sigma Aldrich，目錄號 11666681001）、10% 甲酰胺（Millipore Sigma，目錄號 4650-500 ML 或 Amresco，目錄號 0314-500 ML）洗滌， 0.01% Tween-20（Fisher Scientific，目錄號 BP337-100））與 0 雜交。025 µM 探針在雜交緩衝液（10% 硫酸葡聚糖（Sigma Aldrich，目錄號 D8906-5G）、2X SSC、10% 甲酰胺）中在 37°C 旋轉器中在黑暗中稀釋 48 小時。然後在洗滌緩衝液中洗滌雜交動物，用 DAPI 溶液（洗滌緩衝液中的 1 μg/ml DAPI）避光孵育 30-120 分鐘，在旋轉器中在洗滌緩衝液中洗滌兩次，每次 5 分鐘並用於安裝。將蠕蟲重新懸浮並在室温下孵育 5 分鐘或在 4°C 下在不含酶的 GLOX 緩衝液（2X SSC，1% 葡萄糖（Fisher Scientific，目錄號 D16-500），0.1 M Tris pH 8.0（ Thermofisher Scientific，目錄號 AM9855G）在無 RNase 水中），用新鮮製備的 GLOX 酶緩衝液（100 μl GLOX 緩衝液，1 μl 葡萄糖氧化酶（MP Biomedicals/Fisher Scientific，目錄號 0219519610），3.7 mg/ml，1 μl 過氧化氫酶（Fisher Scientific，目錄號 S25239A），1 μl 200 mM Trolox（Acros Organics/Fisher Scientific，目錄號 218940050））並通過將樣品滴在蓋玻片上然後放置並密封在顯微鏡載玻片上準備成像凡士林、羊毛脂和石蠟的混合物。單個實驗組內的所有樣品均包括對照菌株，並經受相同條件（例如孵育時間）以最小化實驗內的變異性。所有 smFISH 實驗均使用無 RNase 條件。單個實驗組內的所有樣品均包括對照菌株，並經受相同條件（例如孵育時間）以最小化實驗內的變異性。所有 smFISH 實驗均使用無 RNase 條件。單個實驗組內的所有樣品均包括對照菌株，並經受相同條件（例如孵育時間）以最小化實驗內的變異性。所有 smFISH 實驗均使用無 RNase 條件。

AMJ1259、AMJ1260 和 AMJ1261 雌性與 AMJ1045 或 EG6787 雄性交配，並且在 L4 後約 24 小時分期的交叉後代雌雄同體的擠壓性腺使用mCherry探針進行 smFISH 協議（補充圖 4b）。對於補充圖 6a、b，EG6787（“ T ”）、AMJ552（“ iT ”）和 N2（“野生型”）成年雌雄同體在 L4 後約 24 小時上演的擠壓性腺使用 smFISH 協議進行mCherry或gfp探針。對於補充圖 2e頂行，在 L4 後約 24 小時分期的 EG6787、AMJ1170、JH3323 和 N2 成年雌雄同體的擠壓性腺使用mCherry單獨探測。對於補充圖 2e底行，在 L4 後約 24 小時上演的 EG6787、AMJ1195、JH3197 和 N2 成年雌雄同體的擠壓性腺僅使用gfp探針進行 smFISH 協議。

共聚焦顯微鏡對單分子 RNA 信號或蛋白質熒光進行成像圖像是使用 Leica SP5 共聚焦顯微鏡和 ×63 油浸物鏡以 500% 數字變焦拍攝 smFISH 樣品和 400% 數字變焦拍攝蛋白質熒光。在對應於解剖性腺的遠端、環或近端區域的區域捕獲了一個 0.5 µm 厚的共焦切片。對於在大多數解剖的性腺中成像的所有三個區域，Z 位置被定向為與遠端尖端細胞的細胞核相同的平面。為了對 smFISH 的 L2 和 L3 階段之間的整個蠕蟲進行成像，以 0.5-1 的步長對可以在與解剖性腺相同的放大倍數下容納在視野內的部分生殖系的 Z 堆棧進行成像µm 並顯示為最大強度投影。明場和 DAPI 圖像是使用光電倍增管拍攝的，而mCherry和gfp RNA 和蛋白質熒光圖像是使用混合檢測器 (HyD) 拍攝的。對於 smFISH 和蛋白質熒光，XY 激光掃描設置為 400 Hz，並以 1024 × 1024 像素的分辨率成像。Quasar 670 探針使用 Alexa 633 nm 激光（50% 白光激光）激發，在 650 到 715 nm 之間檢測到信號，針孔為 105.05 µm。DAPI 使用 405 nm（3–30% 紫外激光）激發，在 422 到 481 nm 之間採集信號，針孔為 95.52 µm。對於 Quasar 670 和 mCherry 或 GFP 蛋白熒光，使用 6-8 線平均值和 1-2 幀累積。對於 DAPI，使用 3-4 行平均值。

沉默的量化和熒光強度的測量為了對成像後的熒光強度進行分類，在使用 3 mM 左旋咪唑（Sigma-Aldrich，Cat# 196142）使蠕蟲麻痹後，將 L4 階段或 L4 階段後 24 小時的動物安裝在載玻片上，在非飽和條件下成像（尼康） AZ100 顯微鏡和 Photometrics Cool SNAP HQ 2相機），並分為三組 - 明亮、暗淡和關閉。C-HGFI Intensilight Hg Illuminator 用於激發 GFP 或 Dendra2（濾光立方：450-490 nm 激發、495 二向色性和 500-550 nm 發射）或 mCherry 或 RFP（濾光立方：530-560 nm 激發、570二向色和 590-650 nm 發射）。檢查未被腸道自發熒光遮蔽的性腺切片，以對來自oxSi487 的GFP 和 mCherry 熒光進行分類. 在對 GFP 或 Dendra2 進行成像時，自發熒光很明顯，但在對 mCherry 進行成像時則不然。

在某些情況下，在圖6c和補充圖8h 中的 L4 階段或補充圖中 的 L4 階段後 24 小時，在沒有成像的情況下通過眼睛對種系內的熒光強度進行評分 。 5e、f（尋找明亮的男性 F1s）、7b（尋找男性 F1s）和8a在固定放大倍數和變焦下使用 Olympus MVX10 熒光顯微鏡無成像。

為了定量測量來自使用 Nikon AZ100 成像的T的 mCherry 和 GFP 的蛋白質熒光（圖 1c）和來自其他轉基因的蛋白質熒光（圖 4g、5b左圖和補充圖 8a-f），感興趣區域（ROI） ) 使用 NIS 元素或 ImageJ (NIH) 進行標記，並測量強度。從每個圖像的測量強度中減去背景。對於無花果。 1c、4g、5b和補充圖 8a-f，熒光強度測量為 x - b，其中 x = ROI 的平均強度，b = 背景的平均強度。將獲得的強度值轉換為 log 2標度並作圖。

在餵食 RNAi 的實驗中，每個菌株的靶基因 ( gfp ) 和對照 RNAi 餵養的動物在相同的曝光下成像。對照和實驗動物都在非飽和條件下以固定曝光或通過將曝光設置為各自的對照進行成像。以前的報告表明，咽，神經元和肌肉外陰可通過雙鏈RNA沉默抗性69，70，因此不包括在我們的得分。

所有被比較的圖像都使用 Adobe Photoshop 進行了相同的調整以進行顯示。

從 Tgfp 量化表達將Tgfp插入基因組導致所有動物的 GFP 表達可變。然而，在交配誘導沉默的情況下，通過量化測量，沉默的動物沒有顯示出可檢測到的 GFP 沉默。為了定量測量來自Tgfp的 GFP 熒光（補充圖 1f），使用斐濟（NIH）標記排除腸道的種系的 ROI，並測量強度。測量同一圖像內蠕蟲外部的區域的背景強度。如上所述，通過從測量的 GFP 強度中減去背景強度來計算來自Tgfp表達的平均熒光強度。

smFISH 信號的量化在斐濟 (NIH) 打開徠卡圖像（.lif 格式），調整顯示範圍，使用 50 像素（~2.7 µm）的滾球半徑依次減去背景兩次，調整閾值，RNA 點數≤250物體體素的大小被量化為每單位面積。在比較的菌株圖像中，所有參數都進行了相同的調整。所有被比較的圖像都使用 Adobe Photoshop 進行了相同的調整以進行顯示。

mCherry和gfp轉錄本的smFISH 信號（圖 1b和補充圖1b）之間的共定位是使用斐濟內的共定位色圖 插件完成的。插件查找從使用下式的兩個圖像之間的相同的空間座標的像素強度之間的相關性：[（該像素的強度的mCherry RNA圖像-在平均像素強度的mCherry RNA圖像）×在（像素的強度GFP RNA圖像− gfp RNA 圖像中的平均像素強度)]/[( mCherry RNA 圖像中的最大像素強度− mCherry 中的平均像素強度RNA圖像）×（以最大像素強度GFP RNA圖像-在平均像素強度GFP RNA圖像）。相關值的範圍在 1（最共定位）到 -1（最不共定位）之間，並由圖中的比例表示。原始 mCherry 圖像包含來自 mCherry::H2B（代表核染色質）和來自使用 Quasar 570 探針探測的mCherry RNA 的熒光信號。由於 mCherry 和 Quasar 570 的熒光光譜之間有很大的重疊，這些圖像同時捕獲了 mCherry 蛋白質和 RNA 信號。使用這些圖像，我們獲得了mCherry的近似值RNA 信號通過使用 DAPI 圖像減去 mCherry::H2B 信號，其信號與 mCherry::H2B 信號一致，但與mCherry RNA 信號不一致。然後使用所得的減影圖像（mCherry 蛋白 +  mCherry RNA - DAPI）來檢查mCherryRNA 和gfp RNA之間的共定位程度（圖 1b和補充圖 1b）。

統計分析、再現性和繪圖對於每個圖，使用χ**2檢驗來比較圖例中所示的數據，除非在被比較的兩個數據集中僅存在一個類別（明亮或靜音）的情況下，在這種情況下使用威爾遜對比例的估計。顯示的所有比較包括每個實驗中僅 GFP 熒光或僅 mCherry 熒光之間的比較。使用學生t檢驗（圖 2a（Tgfp），補充圖1f、2c、6c、f、g） 比較 ChIP 和 qRT-PCR 實驗和雜交的意義）。Matlab、R 和 Microsoft Excel 用於繪製熒光強度（條形圖、玫瑰圖、箱線圖、點圖、線圖）和 qPCR 數據。源數據中提供了準確的P值。每個實驗的生物學重複如圖、圖例和方法所示。實驗進行一次或在源數據中指示的次數作為遺傳雜交的獨立交叉板。多個作者重複了關鍵實驗（8 個作者的交配誘導沉默，2 個作者的pgl-1依賴性沉默）。在這些情況下，結果是可重現的。呈現的代表性圖像來自不同的成像會話，其中觀察到類似的模式和成像會話的數量，如下所示：圖 2。 圖1a顯示了來自>10只動物的>10個會話的代表性圖像；圖 1c顯示了每個類別 5-11 只動物的 1 個會話的代表性圖像；圖 2c來自 2 個會話和 92 只動物的馬賽克表達（也用sur-5::gfp測試了馬賽克，顯示了類似的結果）；圖 6a來自 1 個會話和 7 個動物的代表性 RNAi；圖 1b和補充圖 1b 代表 2 個會話和 6 個性腺的共定位圖。

報告摘要有關研究設計的更多信息，請參見與本文鏈接的 自然研究報告摘要。

數據可用性

本研究期間生成或分析的所有數據都包含在這篇已發表的文章（及其補充信息文件）中。在這項研究中生成了 10,000 多張圖像來記錄表達水平。作者可應合理要求提供支持本研究結果的這些圖像和其他數據。本文的源數據在