石正麗團隊發表冠狀病毒新研究，進一步證明新冠非實驗室泄漏

新冠病毒SARS-CoV-2造成了近一個世紀以來最具破壞性的大流行COVID-19，而其中尚未解決的科學問題之一是這種病毒的自然來源。

近日，來自中科院武漢病毒所、中國科學院大學的研究人員在預印本網站BioRxiv上提交了一篇論文，題為“Identification of a novel lineage bat SARS-related coronaviruses that use bat ACE2 receptor”。他們報告在雲南省墨江縣通關鎮發現的蝙蝠身上鑑定出的新的SARS-CoV-2相關病毒病毒譜系，這些病毒採樣於2015年，地點和研究團隊此前報告的來源於中菊頭蝠、與SARS-CoV-2基因組一致性達96.2%的RaTG13系同一地點。

該論文的通訊作者為中科院武漢病毒所新發傳染病研究中心主任、武漢國家生物安全實驗室（四級）副主任石正麗和中科院武漢病毒所蝙蝠病毒感染與免疫學科組組長周鵬。

研發同時指出，根據現在的研究發現，目前發現的能被分離出的蝙蝠SARSr-CoV-2系或新譜系病毒均無法有效利用人類ACE2。因此，如果不進行適應，對人類的溢出風險還比較小。相比之下，從使用受體的情況來看，穿山甲冠狀病毒具有較高的溢出風險。

他們還進一步強調，儘管此前有推測稱，可能是實驗室的RaTG13泄漏導致了SARS-CoV-2，但現有的實驗證據並不支持這一推測。

石正麗等人在這項研究中強調，目前我們在蝙蝠身上發現的SARS樣冠狀病毒可能只是冰山一角。未來應進行更系統性和縱向的監測，防止病毒再次造成重大溢出事件。

不同於SARSr-CoV-1和SARSr-CoV-2的新譜系

論文中寫道，2015年5月，研究團隊在墨江縣進行蝙蝠採樣。蝙蝠在肛門拭子取樣後被釋放，樣品在-80°C條件下保存直到使用。

在蝙蝠中追蹤SARS-CoV-2起源時，研究團隊此前發現了RaTG13，它與SARS-CoV-2的基因組同源性為96.2%，這是迄今為止最接近的基因組。

他們對2015年於同一地點採集的蝙蝠樣本進一步調查時發現，其中8個樣本的序列與SARS-CoV-2序列同源性為93.5%。7份來自小褐菊頭蝠（Rhinolophus stheno），另1份來自中菊頭蝠（Rhinolophus affinis）。

因此，他們進行了下一代測序（NGS），以進一步分析這些冠狀病毒，所有8個樣本均獲得全基因組序列。這8個SARSr-CoV基因組幾乎相同，彼此之間的序列一致性超過99.7%。研究團隊以其中一株、被命名為RaTG15的病毒株為代表進行了進一步分析。

在用於冠狀病毒分類的7個保守複製酶結構域中，RaTG15與SARS-CoV-2和SARS-CoV-1的同源性分別為95.3%和92.5%，表明其屬於冠狀病毒科Betacoronavirus屬的Sarbecovirus亞屬中的SARSr-CoV種。

此外，RaTG15在開放閲讀框1b （ORF1b）與SARS-CoV-2基因接近。在完整的ORF1b區，RaTG15與來自中國和東南亞的野生蝙蝠SARSr-CoV-2的核苷酸序列同源性為84.6%-89.0%，氨基酸序列同源性為95.6%-97.3%，這其中包括來自雲南的蝙蝠冠狀病毒RaTG13和RmYN02，日本的Rc-o319，柬埔寨的RshSTT182，泰國的RacCS203，以及兩個穿山甲冠狀病毒株。

研究發現，相比之下，除上述ORF1b外，RaTG15與SARSr-CoV-2和SARSr-CoV-1在大多數基因組中均有顯著差異。ORF1a、M和N的基因同源性低於80%，S、ORF3、6和7a/7b的同源性低於70%。

研究得出，總體而言，RaTG15全基因組與SARS-CoV-1序列同源性為74.4%，與SARS-CoV-2序列同源性為77.6%。值得注意的是，RaTG15和SARS-CoV-1在S、E、M、N和ORF6蛋白上的序列一致性比RaTG15和SARS-CoV-2之間的更高。

研究團隊認為，RaTG15在內的這一新的病毒譜系可能是不同SARSr-CoVs重組的結果。

系統發育分析結果也較好支持了這一點。研究團隊指出， SARSr-CoVs此前主要由兩個亞譜系組成，即SARSr-CoV-1和SARSr-CoV-2。後者包括最近在亞洲許多地區報告的穿山甲和不同種類的菊頭蝠中的SARS-CoV-2。在全長基因樹和S基因樹中，RaTG15及其相關病毒均遠離上述現有的兩個亞譜系，由此形成一個新的譜系。

在沒有進一步適應的前提下人畜共患潛力有限

研究人員進一步檢測了RaTG15的S蛋白序列，並與其他SARSr-CoV-2做了對比。

他們發現，RaTG15的S蛋白的受體結合域（RBD）與其他sarbecoviruses病毒高度不同，與SARS-CoV-2的氨基酸同源性為72.6%，與相關的蝙蝠和穿山甲冠狀病毒的氨基酸同源性為68.6%-73.3%。

值得一提的是，和上述提到的RmYN02、RacCS203不同的是，RaTG15 RBD沒有出現一種缺失，也就是對應於SARS-CoV-2 S蛋白中的氨基酸473-486缺失（缺失2），根據此前的研究，該缺失決定對了血管緊張素轉化酶2（ACE2）的利用。然而，和SARS-CoV-2和RaTG13相一致的是，發現了一個與氨基酸444-447（缺失1）相對應的缺失。該處缺失的位置與柬埔寨RshSTT182的位置相似。

另外，在SARS-CoV-2與ACE2受體結合的5個氨基酸殘基中，RaTG15表現出有4個是不同的（486、493、494和501）。此外，與大多數蝙蝠SARSr-CoVs一樣，在RaTG15的S1-S2接合處沒有多鹼基（furin）酶切位點。

論文提到，序列分析表明，RaTG15病毒可能使用ACE2作為進入受體，研究人員也進行了進一步的驗證試驗。使用了來自SARS-CoV-2、SARS-CoV-1、RaTG13、pangolin-CoV-GD、pangolin-CoV-GX和RaTG15的RBD蛋白，以及人類和中菊頭蝠 ACE2蛋白的外區結構域（圖S2A）。

他們發現，中菊頭蝠來源的RaTG13和RaTG15 RBD蛋白對人類ACE2 （HuACE2）的親和力很弱或沒有結合親和力。而兩種穿山SARSr-CoVs的RBD蛋白對HuACE2的結合親和力要高得多，僅略弱於SARS-CoV-2 RBD，但仍高於SARS-CoV-1。pangolin-CoV-GX對HuACE2的結合親和力略弱於pangolin-CoV-GD。

研究人員進一步驗證，相對於利用huACE2，蝙蝠冠狀病毒RaTG13和RaTG15是否能更有效地利用中菊頭蝠ACE2（RaACE2）？結果發現，RaTG15 RBD與RaACE2的親和力也同樣明顯低於SARS-CoV-2和pangolin-CoV-GD/GX對RaACE2的親和力。與在HuACE2中一樣，RaTG13 RBD與RaACE2的結合很弱。

研究人員還進行了假病毒感染試驗。與RBD-ACE2蛋白結合分析一致，HuACE2介導了除RaTG15外的所有SARSr-CoVs的進入，而中菊頭蝠ACE2支持所有SARSr-CoVs的進入。

研究總結認為，無論是SARSr-CoV-2譜系還是此次鑑定出的新譜系病毒，均不能有效結合HuACE2，RBD區域是否存在缺失似乎會極大地影響結合能力。

研究人員認為，這些結果表明，如果沒有進一步的適應，蝙蝠來源的RaTG13、RaTG15以及其他可能的SARSr-CoV-2病毒，它們的人畜共患潛力尚有限。相比之下，從使用細胞受體的情況來看，穿山甲冠狀病毒具有較高的溢出風險。

實驗證據不支持實驗室泄漏導致SARS-CoV-2

總的來説，該研究報告了從蝙蝠身上發現的一種新的SARSr-CoVs譜系，這些病毒與SARS-CoV-2在RdRp區域密切相關，但在基因組水平上與任何已知的SARSr-CoVs都還有距離。

研究人員指出，雖然已從野生動物中檢測到幾種與SARS-CoV-2相關的冠狀病毒，但它們沒有一種在基因組水平上與SARS-CoV-2有99%的基因相同。

需要注意的是，冠狀病毒之間較易發生重組事件，這也被認為是SARS-CoV-1的潛在起源。此前的非典溯源研究中，研究人員在蝙蝠中發現的SARSr-CoVs攜帶所有的SARS-CoV-1基因組片段。而不同野生動物的部分基因組區域與SARS- CoV-2序列高度相似，也提示在跨物種或種間傳播的病毒進化過程中可能病毒重組。

研究人員在論文討論部分指出，他們的研究結果表明，我們現在從蝙蝠身上發現的SARSr-CoVs可能只是冰山一角。這些病毒可能在動物宿主中經歷了選擇或重組事件，使病毒對新宿主產生適應，然後傳播到新物種，直到它們進入人類社會。

他們強調，應該對此次鑑定出的新譜系病毒進行監測，以防止未來疫情的暴發。因為來自SARSr-CoV的另外兩個譜系的病毒，即SARS-CoV-1、SARS-CoV-2，分別導致了非典和COVID-19。

此外，根據現在的研究發現，目前發現的能被分離出的蝙蝠SARSr-CoV-2系或新譜系病毒均無法有效利用人類ACE2，因此，如果不進行適應，對人類的溢出風險還比較小。相比之下，蝙蝠SARSr-CoV-1相關譜系中能利用ACE2的病毒在跨物種傳播方面似乎更危險。

研究提到，RaTG13是現階和SARS-CoV-2最接近的蝙蝠冠狀病毒，但對HuACE2仍僅表現出很弱的結合親和力。

他們強調，儘管此前有推測稱，可能是實驗室的RaTG13泄漏導致了SARS-CoV-2，但現有的實驗證據並不支持這一推測。相比之下，穿山甲冠狀病毒對人類或蝙蝠ACE2具有很強的結合能力，對人類或其他物種具有很高的跨物種潛力。

研究人員分析，在SARS-CoV-2來源於動物的這一背景下，可能存在一種比RaTG13更有效使用HuACE2的蝙蝠SARSr-CoV，或者有一種具備更高基因序列一致性的穿山甲冠狀病毒。

研究最後強調，今後需要對蝙蝠、穿山甲或其他可能的中間宿主動物進行更系統和縱向的抽樣調查，防止未來由SARSr-CoV相關病毒造成的溢出事件，也可以更好地瞭解SARS-CoV-2的來源。

論文鏈接：https：//www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.05.21.445091v1