模擬“提繩打水”，破解多肽納米孔測序瓶頸
這就相當於用繩子在井裏提水桶，如果井是納米孔的話，井繩就是DNA，水桶就是多肽。“井口”的DNA測序酶拉動DNA在納米孔內移動，而DNA又與多肽嵌合在一起，DNA的移動，也就直接拉動了多肽的移動，從而實現了多肽的納米孔測序。
黃碩 南京大學化學化工學院教授
蛋白質是構建生命體的基本物質之一，在合成、催化和信號傳感等所有生命活動中均承擔着重要的功能。開發一種可靠、高效的蛋白質測序技術對於理解生命過程、揭示疾病機理至關重要。作為構成蛋白質的組成片段——多肽成為打開蛋白質這扇大門的鑰匙。
納米孔測序技術是近年來新興的一種單分子測序技術，其中多肽納米孔測序仍面臨諸多挑戰。科技日報記者9月12日從南京大學獲悉，該校化學化工學院研究團隊在國際知名期刊《納米快報》雜誌發表論文稱，他們利用納米孔錯位測序技術，像在水井裏提繩打水一樣，構建了多肽-DNA嵌合鏈，用DNA測序酶與DNA的結合，通過DNA的移動，帶動多肽分子在納米孔內的棘輪運動，從而破解了對多肽進行納米孔測序的技術瓶頸。
現有蛋白質測序技術有缺陷
蛋白質是組成人體一切細胞、組織的重要物質，可以説，沒有蛋白質就沒有生命。而蛋白質的功能是由蛋白質的序列決定的，序列的微小改變，可能導致蛋白質失去生物活性或者誘發疾病。
如果我們能為蛋白質測序，就可以確定蛋白質是否有序列變化，從而判斷其是否會對人類健康產生影響。
“與核酸檢測不同，目前蛋白質測序的難點在於，缺乏有效的序列擴增方法，技術發展上停滯不前，主要靠質譜法和埃德曼降解法來測序。”該論文的通訊作者、南京大學化學化工學院教授黃碩説。
通俗地説，質譜法是用生物酶將蛋白質分解成很多多肽片段，再通過質譜儀器檢測，確定蛋白質片段的信息，最終將這些片段重構成蛋白質序列。而埃德曼降解法是用化學方法將蛋白質N端的一個氨基酸切下來進行鑑定，然後再進行第二輪的氨基酸切割和鑑定，多次循環操作後，確定氨基酸的序列。
但在黃碩看來，這兩個方法都有侷限性。“相較於DNA和RNA測序，構成蛋白質的氨基酸種類更多，質譜法的檢測難度大於核酸測序。而對埃德曼降解法來説，它只能對單一的蛋白質樣品序列解析，如果降解的樣品純度不夠，混合有多種蛋白質樣品，那麼被切下來的氨基酸就會有很多種，就無法確定哪個氨基酸來自哪個蛋白質，從而無法判斷蛋白質的序列。另外，還有一些肽段的末端是封閉的，就不能用降解法。”黃碩介紹。
更重要的是，由於無法實現序列擴增，現有蛋白質測序技術的靈敏度較低，這意味着無法檢測自然界中一些丰度很低的蛋白質樣品。黃碩認為，現有技術難以對複雜環境中的蛋白質直接測序，比如體液、土壤、水體中的蛋白質樣品，要先做一些純化、富集，達到測序的樣品標準，才能在質譜儀中測序。同時，蛋白質的化學修飾很豐富，這也有可能干擾蛋白質測序。
DNA“牽手”多肽“穿行”納米孔
能不能找到一種更微觀的測序方式，只用一個分子就能為蛋白質測序？從2015年開始，納米孔測序技術進入黃碩課題組研究視野。
納米孔測序技術是近年來新興的一種單分子測序技術，已在DNA和RNA測序方面取得成功，它讓單鏈的核酸穿過納米孔，通過納米孔內的檢測器獲得核酸鏈的鹼基信息。
“如果能在單分子水平上為蛋白質測序，我們就能對低丰度蛋白和單細胞蛋白質組學進行更加靈敏的檢測。”黃碩表示，他們課題組受此啓發，開始研究如何用納米孔技術，進行蛋白質或多肽的單分子測序。
但是納米孔測序仍面臨諸多挑戰，其中一個主要的困難是如何實現多肽在納米孔中可控的棘輪運動，而這主要緣於目前沒有和肽鏈相匹配、有很強親和力的多肽測序酶。
黃碩告訴記者：“棘輪運動指的是生物高分子貼着納米孔的內壁，順着同一個方向做勻速、定向運動，類似於附着在齒輪內壁上移動一樣，這需要找到一種酶來控制多肽的運動速度。”
黃碩課題組在多輪嘗試失敗後提出納米孔錯位測序技術。“核酸的納米孔識別位點和酶的反應位點，有一個固定的約14—15個鹼基的錯位，這就形成了一個測序窗口，可以利用這個不受酶反應限制的窗口，實現測序。”黃碩説。
納米孔錯位測序技術能否應用在多肽測序領域？在此次研究中，黃碩課題組將多肽和DNA嵌合成一條鏈條，嵌合鏈的DNA部分為“牽引鏈”，在檢測過程中，DNA測序酶與DNA結合，通過拉動DNA部分，牽動整條鏈在納米孔中的可控棘輪運動，實現多肽的納米孔直接讀取。
黃碩解釋道：“這就相當於用繩子在井裏提水桶，如果井是納米孔的話，井繩就是DNA，水桶就是多肽。‘井口’的DNA測序酶拉動DNA在納米孔內移動，而DNA又與多肽嵌合在一起，DNA的移動，也就直接拉動了多肽的移動，從而實現了多肽的納米孔測序。”
黃碩介紹，經驗證，多肽的納米孔測序信號表現出高度的一致性和序列相關性，由單氨基酸替換引起的電流變化也能被清楚地檢測到。通過將多肽的N端或C端與DNA驅動鏈進行偶聯，實現了對多肽兩端氨基酸序列信息的讀取。
“這意味着，可以對蛋白質單分子進行測序，這為今後的蛋白質高通量測序及蛋白質重構，提供了一個全新的工具。”黃碩説，藉助蛋白質序列研究，可以對蛋白質的功能進行預測，從而幫助理解、解釋相關生命活動。