現貨型CAR-T療法的危機：Cas9基因編輯後，T細胞繁現染色體異常_風聞

2017年，美國 FDA 批准了首款 CAR-T 細胞療法上市，人類進入細胞治療時代，CAR-T 細胞療法在血液類癌症中取得了很好的臨牀效果。目前，已上市的幾款 CAR-T 療法都是使用的來自癌症患者自身的自體 T 細胞，自體細胞療法的優勢在於能夠在患者體內長時間發揮作用，且不產生排異反應，但該方法也存在着許多侷限性，自體細胞療法耗時長，一些急性白血病患者沒有足夠時間等待，此外，許多病情嚴重的患者沒有足夠的 T 細胞用於工程化改造，也沒有足夠的時間來等待改造。因此，許多研究團隊和公司開始致力於開發同種異體細胞療法，異體細胞療法的細胞來源更多樣，可以是外周血、臍帶血，以及人工誘導多能幹細胞（iPSC）等等，該方法更容易批量生產，耗時更少，能夠解決自體細胞療法的多種侷限，也就是所謂的“現貨型”細胞療法。以現貨型 CAR-T 療法為代表的同種異體 T 細胞療法，通常使用基因編輯技術（主要是 CRISPR-Cas9）來敲除 T 細胞受體（TCR）及其他基因，來避免移植後出現的移植物抗宿主病（GvHD）。2022年6月30日，以色列特拉維夫大學的研究人員在 Nature 子刊 Nature Biotechnology 發表了題為：Frequent aneuploidy in primary human T cells after CRISPR–Cas9 cleavage 的研究論文。該研究使用單細胞 RNA 測序技術驗證了  CRISPR-Cas9 基因編輯人類原代 T 細胞後的結果，檢測結果顯示，CRISPR-Cas9 編輯的目標基因所在的染色體出現了頻繁的染色體非整倍性（染色體數目的增加或減少）和染色體截短。這項研究結果表明，染色體的非整倍性和截短是 CRISPR-Cas9 切割 DNA 雙鏈後的常見結果，因此，在使用 CRISPR-Cas9 基因編輯的臨牀試驗中，尤其是基於 CRISPR-Cas9 的細胞療法開發中，應當特別注意監測和儘量降低這種潛在的嚴重染色體變異。

2020年2月，CAR-T 之父 Carl June 教授等人在 Science 期刊發表論文，報道了首個基於基因編輯的 CAR-T 療法治療癌症的人體臨牀試驗結果。該研究通過 CRISPR-Cas9 基因編輯敲除了 T 細胞上的 TCR 和 PD-1，TCR 蛋白的 α 鏈（TCRα）由 TRAC 基因表達，該基因位於14號染色體；TCR 蛋白的 β 鏈（TCRβ）由 TRBC 基因表達，該基因位於7號染色體；PD-1蛋白由 PDCD1 基因表達，該基因位於2號染色體。

圖片來自 Science 論文【2】在這篇最新論文中，研究團隊使用 CRISPR-Cas9 基因編輯技術來敲除人原代 T 細胞的表達 TCR 和 PD-1 的基因，而且使用了和上述 Science 論文中同樣的 gRNA 來靶向敲除 TCR 和 PD-1。然後使用單細胞 RNA 測序來研究編輯後的人原代 T 細胞的結果。實驗結果顯示，在基因編輯4天后，相當比例的原代 T 細胞出現了染色體異常。具體來説，9%的原代 T 細胞出現了14號染色體缺失，1.4%的原代 T 細胞出現了14號染色體增加，表達 TCRα 的基因位於14號染色體。9.9%的原代 T 細胞出現了7號染色體截斷，表達 TCRβ 的基因位於7號染色體。而在編輯的第11天后，仍有0.9%的原代 T 細胞存在14號染色體缺失，進一步證實了這種染色體變異的長期存在。

這項研究表明，染色體非整倍性（染色體數目的增加或減少）和染色體截斷，是 CRISPR-Cas9 基因編輯時對 DNA 雙鏈進行切割後導致的常見後果，因此，在臨牀應用中，應當進行相應的檢測並儘量使其風險最小化。此前已經有大量研究發現並證實，CRISPR-Cas9 基因編輯，由於 Cas9 造成的 DNA 雙鏈斷裂，導致細胞出現染色體大片段鹼基缺失、染色體碎裂、重排等嚴重染色體異常。這些發現提醒了我們應當加強對 CRISPR 基因編輯技術潛在風險的評估和監測。需要指出的是，鹼基編輯（Base Editing），能夠在不造成 DNA 雙鏈斷裂的情況下進行基因編輯，鹼基編輯技術開創者劉如謙教授創立的 Beam therapeutics，以及國內的貝斯生物等，正在通過鹼基編輯技術開發通用型細胞療法，理論上能夠避免 CRISPR-Cas9 基因編輯導致的染色體異常，具有更好的安全性。論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01377-0https://science.sciencemag.org/content/367/6481/eaba7365.abstract來源於公眾號：生物世界