從頭設計人工酶，人工造酶的關鍵里程碑_風聞

文/陳根

今天的地球，有無數的生命在有序地運轉着，而生命正常運轉的背後，則是無數酶分子“兢兢業業”地工作。在微生物的世界中，酶就像一把精密的“鑰匙”，可以開啓不同的催化反應通道，讓生物體產生不同的功能變化。在化工、製藥等行業，酶也因催化效率高、底物專一性強、環境友好等，被廣泛應用。

但自然界中的這些天然的“鑰匙”功能有限並且獲取時間漫長，無法滿足人類日益增長的需求。當酶的功能達不到我們的需求時，改造酶就成為我們的選擇**。當然，改造酶並非易事，不過，人工智能技術的飛速發展，卻給了人工造酶一次全新的機會。**現在，人類已經實現了利用AI從頭設計出全新的酶。 

生命運轉****的精密“鑰匙”

作為生物催化劑，酶的強大之處就在於，可以保證相關化學反應在極為温和的條件下也能高效進行，催化反應的速率往往可以提升幾千倍到上億倍。

比如，食物中的葡萄糖要釋放能量變成水和二氧化碳，這一過程在沒有催化劑的常温常壓下需要幾年的時間，或者在300°以上的高温燃燒氧化才能釋放能量，而在我們的體內，在葡萄糖氧化酶的作用下，這一過程卻無時無刻不在發生。人類的許多疾病，則與酶缺乏或合成障礙有關。

更重要的是酶催化具有高度的專一性，一種酶只催化一種物質發生一種反應，即使結構非常相似的物質也不會反應。這種穩定發生和指向明確的催化效果，在化工、製藥等行業也大有所用。

人們期待用酶催化反應來替代那些複雜多步的化學反應過程，達到縮短工藝流程、降低生產成本、節省試劑使用的目的，但隨着更加生物工程和化學工程越來越精細化，天然酶也越來越難以滿足人們的需求——人工造酶由此而生。

**想要開發新的酶，先要了解酶——酶的本質，其實就是蛋白質，因此生物酶也被稱為酶蛋白。**蛋白質的功能主要由它的結構，即蛋白摺疊方式來決定，而其結構則由基本構成單位——氨基酸的序列來決定。以最簡單的，有50個氨基酸殘基的酶蛋白為例，其結構功能的可能數目就是個天文數字。酶的催化作用正有賴於酶分子的摺疊三維空間結構。

蛋白質的活性位點經過數百萬年的進化演變而來，實現了不可思議的高選擇性化學轉變。基於此，科學家開始嘗試修飾蛋白質的活性位點並引入新的金屬-配位結構。儘管早期的結果的確充滿希望，但由於這一過程過於漫長，以至於在20世紀70年代後這個領域沉寂了25年之久。千禧年之交，隨着基因重組與蛋白表達技術的成熟，才為基於蛋白質改造的人工酶領域帶來新的曙光。

**目前，科學家們主要****通過定向進化技術和人工酶設計技術來提升酶的催化性能。**定向進化技術是指通過大量的隨機突變和重組，模擬自然界中酶的進化過程，再從眾多結果中篩選出符合人們要求的酶，簡單來説就是根據一些原理依據進行窮舉。2018年，加州理工大學弗朗西斯·阿諾德教授獲得了諾貝爾化學獎，以表彰她在酶的定向進化方面的貢獻。

人工酶設計則是基於已解析的蛋白質晶體結構和一定的酶催化機理，在計算機上建立酶和底物的催化模型，充分利用計算機強大的計算能力，快速進行大量突變體的篩選過程。這種方法相比於定向進化，能夠大大縮短新酶的開發週期。迄今為止人類已經發現了5000多種酶。

**近年來，在AI蛋白質結構預測的浪潮下，人工設計蛋白質技術也得到了飛速的發展，**包括出現了各式各樣的支架蛋白、小型功能蛋白和自組裝單元蛋白的AI設計工作。現在，人類已經實現了利用AI從頭設計出全新的酶。 

首個從頭設計的酶****分子

實際上，在多年前，科學家就已經嘗試從頭設計酶分子（de novo enzyme design），然而，由於諸多限制而未能取得重要突破。

**酶分子在催化化學反應的第一個步驟是通過酶上的活性位點與所催化的底物結合，形成酶-底物複合物。**接着酶分子通過穩定催化反應發生所必需的高能過渡態來促使化學反應的進行。因此，在進行從頭酶分子設計時的首要步驟便是識別活性位點以及可與底物結合的口袋，但這經常因為現有蛋白結構文庫缺乏合適的蛋白結構，以及天然蛋白序列-結構關係的複雜性而受到限制。

常常僅改變酶分子中少數氨基酸的序列，便造成蛋白質產生不可預測的結構變化，因此，科學家需要設計出能夠與底物具高度選擇性結合，並精確催化化學反應的酶分子並不容易，尤其是當具有相似結構的底物同時存在之時。

除了酶分子需要能與底物專一性地結合，如何優化氨基酸序列與結構，使得所設計出來的酶分子具有高度活性與催化效力也是科學家所面對的一大難題，這需要對酶分子的活性位點有更進一步、精確的控制才得以實現。

為了達成從頭設計有效、具專一性酶分子的挑戰，許多科技與方法也應運而生，比如，使用量子力學/分子力學計算來模擬化學反應機制以及像是蛋白設計平台Rosetta與AlphaFold等等，都為酶分子從頭設計帶來潛在的貢獻。

2 月 22 日，美國華盛頓大學生物蛋白質設計研究所（Institute for Protein Design）主任 David Baker 團隊在《自然》發表論文，描述了一種使用深度學習從頭設計合成自然界中不存在的高效熒光素酶的方法。

研究人員利用其開發的一種基於深度學習的新蛋白質設計策略“family-wide hallucination”，通過將無約束的從頭設計和固定骨架序列設計方法進行整合，可以生成數量無限的具有期望摺疊的全新蛋白質。

為了實現從頭設計酶分子這項挑戰，Baker教授團隊成員選擇重新設計螢光素酶為目標。螢光素酶能夠催化一種稱為熒光素的底物產生氧化反應，以產生生物發光。然而由於螢光素酶的蛋白結構中含有多個雙硫鍵，因此在蛋白生產時經常有摺疊錯誤的情形發生。此外，許多天然的螢光素酶無法辨認人工製造的熒光素或產生所需的熒光特性。這些諸多因素都促使研究人員想要通過重新設計蛋白質，來獲得更加理想、具應用性的熒光素酶。

具體來看，研究人員選擇了熒光素作為反應底物，通過一種基於深度學習的方法以及Rosetta蛋白序列設計平台，篩選出 NTF2 樣摺疊的目標拓撲結構，通過對該摺疊可變區域的無約束從頭設計以及結構引導的序列優化，設計了可選擇性催化發光的人造熒光素酶。

在實驗室製造和測試的酶中，研究人員在他們的初始設計中確定了三種活性酶。他們將表現最好的一部命名為**“LuxSit”，****值得一提的是，《LuxSit》是根據UW的拉丁語格言“lux sit”改編的戲劇，大致翻譯過來就是“讓光存在”**。LuxSit的許多特性使其成為生物技術研究的一個有吸引力的工具。它只有117個殘基，比任何已知的熒光素酶都要小。該酶與其合成熒光素底物二苯基四嗪(DTZ)的孵育產生480納米的藍色發光，這與底物的化學發光光譜一致。並且發現蛋白質在接近沸騰的條件下保持部分摺疊。 

人工造酶****的關鍵里程碑

這項能夠從頭設計具高活性和高特異性酶分子的實驗成果，可以被任務是人工造酶的關鍵里程碑。研究人員表示，他們能夠在計算機上從頭開始設計非常有效的酶，而不是依賴於自然界中發現的酶。這一突破意味着，原則上，幾乎任何化學反應的定製酶都可以被設計出來。

一方面，這也讓我們看到了深度學習在人工酶方面的力量。除了LuxSit外，研究團隊還在繼續設計其他熒光素酶，識別另一種合成熒光素底物——2-脱氧腔腸素或h-CTZ。因為h-CTZ的分子形狀不同於DTZ，為了創造活性位點，研究人員安裝了組氨酸和精氨酸側鏈的精確排列。這些活性位點特徵是根據在第一輪熒光素酶設計中觀察到的成功案例來模擬的。

這一次，研究小組沒有采用Rosetta Design，而是轉向了最近開發的ProteinMPNN工具，以得出新酶的剩餘氨基酸序列。ProteinMPNN是一個由深度學習驅動的序列設計工具，運行時間約為一秒，比以前最好的軟件快200多倍。它的結果優於以前的工具，並且它不需要專家定製來運行。

在實驗室測試的46種設計的h-CTZ催化劑中，研究人員發現了兩種具有可測量的熒光素酶活性。**這標誌着第二輪從頭酶設計的成功率增加了十倍，從0.04%增加到4.35%。**這種改進可能是由於在第一輪設計中獲得的知識以及ProteinMPNN性能的提高。

到目前為止，計算酶設計一直受到可用蛋白質支架數量的限制，以及在其中放置酶活性位點的極端困難。**而顯然，**使用深度學習來生產大量定製蛋白質支架，以及下一代蛋白質序列設計工具，為酶設計的新時代奠定了基礎。

另一方面，酶分子的廣闊應用性預示了此項技術的潛在巨大影響力。新的酶分子可能有益於生物技術、醫學、環境修復和製造。例如，在生物技術中，酶可以改善生物燃料生產、食品加工和藥品製造。在醫學上，酶可以作為治療和診斷工具。酶設計可以通過分解污染物或清理被污染的場所來改善環境。而酶也可能有助於生產生物降解塑料和粘合劑等新材料。

近年來，AI在預測蛋白質三維結構和合成全新蛋白方面不斷取得突破。而此次科學家達成從頭設計酶分子這項挑戰，更顯示此技術朝着改變人類生活又近了一步。讓我們期待這項科學突破能夠儘快獲得轉化，在生物醫學上獲得應用以造福大眾。