錯失諾獎，只因太聽大牛的話丨病毒超話_風聞
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守法而弗變則悖。 ——《呂氏春秋》
撰文 | 江豔君、李慶超（山東師範大學）
在17世紀人類歷史上的首次經濟泡沫中，帶條紋的鬱金香是投資者追捧的對象，當時，一枚類似上圖的鬱金香球莖動輒數千荷蘭盾，價格相當於一個工人十多年的收入，這就是所謂的“鬱金香狂熱”（Tulip mania）。現在我們知道，這種珍稀的條紋是由“鬱金香碎色病毒”（Tulip breaking virus，TBV）感染造成的。
實際上，人類發現的第一個病毒就是一種感染植物的病毒，名為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV，直譯過來是“煙草馬賽克病毒”）。它是人類探索微生物過程中的一座里程碑。
一
不知所蹤
1879年，德國植物病原學家Adolf Mayer開始研究一種煙草疾病。這種病能讓煙草葉片呈現出深綠色和淺綠色的不規則圖案，還會枯萎、起皺，進而導致煙草減產。根據患病煙草的損傷特徵， Mayer把這種病稱為“煙草馬賽克病”（tobacco mosaic disease，漢譯為“煙草花葉病”），並認為它是由某種病原菌引起的。
此時的微生物學正經歷着高速發展的黃金時代。發現了炭疽、結核病和霍亂致病細菌的德國科學家羅伯特·科赫（Robert Koch）是這一時代的關鍵人物。他於1890完善並發表了著名的“科赫法則”（Koch’s Postulates），用於建立病原體與疾病之間的確切關係。內容如下：
1. 所有患某病的個體中均存在某微生物，但健康個體中不存在該種微生物。
2. 必須從患病個體中分離到這種微生物，並在實驗室內進行純培養。
3. 將實驗室培養的此微生物接種給健康個體後必須引起相同的疾病。
4. 接種後患病的個體身上必須能夠再次分離到此種微生物。
符合上述準則，即可證明這種微生物導致了這種疾病。運用科赫法則，人們鑑定出了很多病原微生物。Mayer研究煙草疾病，遵循的也是這一思路。
通過一個關鍵的實驗，Mayer證明了馬賽克病是具有傳染性的：將患病葉片搗碎浸泡在水中，得到綠色懸浮液體，用玻璃毛細管吸入微量的汁液並注入健康煙草植株的葉脈中，一段時間後，10株接受注射的植株有9株出現了相同的馬賽克狀病變。這充分説明患病葉片搗碎製作的汁液具有傳染性。
但是，Mayer並沒有在這些汁液中發現細菌。他想用濾紙濾除汁液中的細菌，但過濾後的汁液依然致病。當時過濾葉片汁液的技術有限，僅僅依靠濾紙進行粗濾。因此，他堅持認為，引起植物病症的微生物是一種極小的、在顯微鏡下不可見的細菌，並斷言通過多次過濾能夠獲得不含該病菌的純淨汁液。
二
失之交臂
直到1884年，法國科學家巴斯德的助手張伯倫（Charles Chamberland）發明了一種陶瓷濾器，可以過濾當時已知的最小病原體——也就是細菌，稱為張伯倫濾器（Chamberland filter）。這樣，藉助這種能夠濾除細菌的濾器，人們就可以比較含有細菌的患病個體提取液和不含細菌的提取液的致病能力，從而研究細菌性傳染病和細菌毒素。
1887年，俄國植物學家Dmitri Ivanovsky 在研究克里米亞的煙草花葉病時，將患病葉片的汁液通過多孔陶瓷製成的細菌過濾器進行過濾，再將過濾後的汁液塗抹在健康的煙草葉片上，卻發現健康葉片同樣呈現出類似患病葉片的斑駁黃色。這一結果表明，這種病害的病原體可以通過細菌濾器，暗示着煙草花葉病有可能並不是人們熟知的細菌引起的。但秉持着嚴謹務實的精神，Iwanowski還是在1892年公開發表的文章中提出，導致煙草花葉病的是某種可過濾性的細菌或其分泌的毒素。畢竟，世界上總還是有可能存在更小的細菌，小到連張伯倫濾器也濾不掉的呀！
Iwanowski的實驗結果引起了許多科學家的興趣，一位名叫Martinus Beijerinck的荷蘭微生物學家（圖6）獨立進行了一個幾乎與Iwanowski相同的實驗，但他還將經陶瓷濾器過濾後的煙葉汁液塗抹在了瓊脂上（瓊脂是一種微生物固體培養基配置的常用試劑，類似果凍、仙草凍成分一類的東西）。一段時間後，他發現這種神秘的致病物質竟然可以擴散進入瓊脂。而一般來説，細菌只能在瓊脂固體培養基表面生長，形成菌落，極少能夠擴散到固體培養基內部。當然，細菌毒素也可以在瓊脂中擴散，因此，這種致病物質要麼是一種新的病原體，要麼是毒素。
同時，Beijerinck還把受感染葉片（圖中的葉片②）的汁液重新過濾後塗抹在另一株健康植物上，發現健康植物同樣能夠患病。這説明，新的健康葉片是被感染了，而不是中毒（接觸毒素），因為只有病原體才會繁殖變多，源源不斷地感染新的葉片，而毒素的量是有限的，會稀釋、會消失。
綜上，這是一種神秘的生物，能夠在致病力不減弱的條件下傳播，而且好像只能在葉片中繁殖，一旦離開了煙草葉片，它似乎也就銷聲匿跡了。1898年，Beijerinck公開發表了他的發現，並將這種具有傳染性的、能夠在過濾後仍然保持活性的、類似液體的新型病原體用拉丁短語“contagium vivum fluidum”的縮寫“virus”（病毒）來表示。
作為第一個提出“病毒”這一概念的科學家，Beijerinck的工作可謂是奠定了病毒學的基礎。儘管他錯誤地認為病毒是一種“毒液”（但其實是顆粒）。然而，在那個時代，他的實驗結論看起來太過激進，與早期細菌理論發生衝突，因此他觀點並沒有得到普遍認可，甚至遭到了先前研究者Iwanowski的口誅筆伐。
“這個問題早就下定論了。”Iwanowski如是説。
三
廬山真面
很顯然，一旦某位大牛的觀點被充分肯定後，它的地位便很難被輕易撼動，在當時的微生物領域中，科赫提出的研究法則擁有黃金般至高無上的地位，同時也變成了套在科學家腦袋裏的一個枷鎖。
實際上，這一時期在研究其他疾病的過程中，許多科學家的實驗結論似乎都站在了Beijerinck這一邊，但由於無法使用顯微鏡直接觀察濾過性病原體，20世紀20年代發現的許多與濾過性病原體有關的疾病都無法得到準確定論。這類疾病的病原體究竟是微小細菌、細菌分泌物還是其他物質，這種濾過性病原體的本質究竟是什麼，始終都沒有一個靠譜的答案。“病毒還是猶抱琵琶，不願向世人展示真正的面目。
直到1935年，Beijerinck的猜測終於被美國化學家Wendell M. Stanley證實。Stanley認為，煙葉上的濾過性病原體可能是一種蛋白質分子，並首先通過X射線衍射觀察到了從病葉榨汁中分離出的病毒晶體（其實最清晰的煙草花葉病毒X射線衍射圖像是由發現DNA雙螺旋結構的Rosalind Franklin獲得的，這位女科學家簡直非同小可），同時瞭解到這個晶體當中還含有核酸成分，這一發現為他贏得了1946年的諾貝爾化學獎。1941年，隨着電子顯微鏡的問世，人們才終於獲得了第一張呈現煙草花葉病毒形態結構的照片 (圖6)，這個細瘦的棍棒狀病毒可算是露出了廬山真面目。
煙草花葉病毒（TMV）是一種單鏈RNA病毒（圖7），是煙草花葉病等植物疾病的病原體，屬於Tobamovirus羣。TMV病毒粒體為直杆狀，長約300納米、直徑約為15納米，有一條長約6400鹼基的單鏈正義RNA（+ssRNA）基因組。TMV的基因組RNA這的3’末端具有tRNA樣結構，5’末端具有甲基化核苷酸帽。
TMV基因組編碼4個開放閲讀框（open reading frames，ORF），其中的兩個ORF由於核糖體通讀導致只產生一個蛋白質分子，這4個基因分別編碼複製酶（含有甲基轉移酶[MT]和RNA解旋酶[Hel]結構域）、RNA依賴的RNA聚合酶、病毒的運動蛋白（movement protein，MP）和衣殼蛋白（capsid protein ，CP）。核酸被2130個蛋白質亞基組成的衣殼所包裹，衣殼是由衣殼蛋白自組裝成形成的棒狀螺旋結構，構成了煙草花葉病毒的棒狀外觀。
煙草花葉病毒（TMV）專門感染植物，主要感染經濟作物煙草，造成巨大的經濟損失。煙草花葉病的防治也是以煙株為主要對象，加強煙株保健栽培，切斷傳播途徑，突出抗性誘導並採取化學藥劑輔助。
但實際上，TMV的寄主範圍極為廣泛，現已知對單子葉植物22科中的198種植物具有侵染性。TMV有不同株系，我國主要有普通株系、番茄株系、黃斑株系和珠斑等4個株系，致病力不同，引發的症狀不同；與其他病毒複合侵染所造成的症狀也具有多樣性。
TMV主要通過汁液傳播，當葉片輕微摩擦造成微傷口時，侵入葉片細胞，在薄壁細胞內繁殖，後進入維管束組織傳染整株。同時，煙田中的蝗蟲、煙青蟲等咀嚼式口器的昆蟲也可傳播TMV。
TMV是一種極其穩定的病毒，有極強的致病力和環境抗性，在幹煙葉中能存活長達52年，稀釋100萬倍後仍具有侵染活性，在乾燥的葉子上，它可以持續30分鐘承受高達50℃的温度。因此，在温室幹活兒的種植工人，如果平時吸煙的話，就有可能對温室植物造成威脅。不過，話説回來，也正是因為TMV的穩定性如此之好，人們才能夠發現它。
四
豐碑獻禮
煙草花葉病毒（TMV）作為首個被人類發現的病毒，在病毒學研究史上具有開創性的意義。與其他微生物學研究類似，研究TMV病毒的過程中，科學家也獲得了一些對生命科學發展極其重要的結論。在研究“遺傳物質的本質究竟是什麼”的過程中，TMV告訴我們，RNA也可以做遺傳物質。
1936年，英國洛桑農業實驗站植物病理部門的Frederick Bawden和劍橋大學病理系的Norman Pirie合作，對用沉澱方法精製出的煙草花葉病毒結晶進行檢測，發現結晶中的含氮量為16.7%、含磷量為0.5%、含糖量為2.5%。他們深入研究後指出：煙草花葉病毒大約是由95%的蛋白質和5%的RNA組成的核酸蛋白質複合體。
Bawden和Pirie雖然證明了煙草花葉病毒中含有RNA，但是他們並沒有發現RNA作為基因組攜帶着重要的遺傳信息。Bawden的弟子B. D. Harrison曾在文章中談到，Bawden和Pirie當時曾嘗試研究RNA是否具有傳染性，但可能是由於兩人的實驗室相距有50英里，等Pirie把分離出的RNA運送給Bawden時，RNA已經失活，所以Bawden和Pirie未能發現RNA的傳染性，錯失了RNA作為遺傳物質這一重大發現
（敬告各位領導，請給科研人員創造工作和生活的各種便利）。
“TMV是一種蛋白質，而RNA要麼是污染物，要麼起了結構性作用”,這是當時科學家的推斷。眾所周知，病毒可能包含DNA（例如痘病毒、腺病毒等）或RNA（例如流行性感冒病毒、冠狀病毒等）。但多年來，人們一直認為基因組僅由DNA組成（1944年肺炎球菌的轉化實驗、1952年T2噬菌體實驗）。煙草花葉病毒中只有RNA？顯然“出大事了”。
最終，20年後，德國科學家Alfred Gierer和Gerhard Schramm於1956年發現了RNA具有感染能力。他們將TMV放在水和苯酚中震盪，使RNA與蛋白質分離後，再用提純過的RNA去給煙草接種，結果煙草葉子上出現了典型的花葉病斑。而當用核糖核酸酶對RNA進行處理，令RNA分解，再給煙草接種，煙草葉子上並不會出現病斑。經過一系列實驗驗證之後，Gierer和Schramm指出，煙草花葉病毒的RNA成分在接種後的煙草葉片中能夠合成出新的煙草花葉病毒，因此，RNA是一種遺傳物質！第二年，德國生化學家Heinz Fraenkel-Conrat和他的妻子Beatrice Singer通過病毒重建實驗進一步證實了Gierer和Schramm的上述結論（圖9）。
五
弗變則悖
《呂氏春秋·覽·慎大覽》有云：“治國無法則亂，守法而弗變則悖，悖亂不可以持國。”治理國家沒有一定的法制就會大亂，死守故法不知變革也會大亂。科學研究也是這樣一個不斷變動的過程：要建立觀點去揭示真理，但更強調修正甚至推翻陳舊或錯誤的觀點。
科赫法則在早期病原學研究中具有不可磨滅的指導作用，但也成為某些人的“精神枷鎖”。“Koch’s Postulates”並不是law或rule，而是四條“假設”，是判定微生物之為病原體所需要滿足的條件。實際上，許多病原體的特徵並不完全符合科赫法則所要求的條件。例如，霍亂弧菌也存在於健康人體內，這違反了原始科赫法則的第一條；HIV不能在體外獨立培養（需要在活細胞內才能複製），這不滿足科赫法則的第二條。直到20世紀80年代，科赫法則的“原教旨派 ”還在用最陳舊的科赫法則版本來質疑HIV的存在，質疑幽門螺桿菌與胃潰瘍之間的關係。但這不能怪科赫，因為他本人後來發現了感染霍亂或傷寒的無症狀攜帶者，從而修正了第一條法則中“健康個體中不存在該種微生物”的嚴格要求。
隨着科學技術不斷發展，以DNA結構發現為標誌的現代生物技術使病原學研究的面貌發生了巨大的變化。美國微生物學家Stanley Falkow圍繞“毒力因子”致病的分子證據，提出了“分子科赫假設”（Molecular Koch’s postulates）。1996 年，David Fredricks 和 David Relman又建立了包含七條內容的微生物與疾病因果關係的分子指南。這些理論的核心是發現與致病有關的病原體的分子證據。在本次新冠疫情中，“不明原因肺炎”出現不到兩週，科學家就發現其病原體為新型冠狀病毒SARS-CoV-2，就是成功的“以病毒基因組序列為關鍵證據”的病原學研究實踐。
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