我們為什麼能聞到各種氣味？一個非常基礎但極為複雜的科學問題_風聞
返朴-返朴官方账号-关注返朴（ID：fanpu2019）,阅读更多！06-14 09:12
撰文 | 陳慶超（劍橋大學MRC分子生物學實驗室博士後）
在多樣化的物質世界中，有一種世界，我們看不見摸不着，卻能真真切切地感受到。它或是來自雨後泥土和青草的芬芳，或是來自餐桌上美食飄香的誘惑，它甚至存在於記憶中，連起情感的細流，這便是“氣味的世界”。
氣味有數以百萬計不同種類，每種氣味都由數百個化學分子組成，其性質各不相同。我們為什麼能感受並辨別如此複雜多樣的氣味？長期以來，這是生物學上較少探索但極為重要的科學問題之一。
事實上，“感受”和“辨別”是兩個不同的生物學問題：一是我們的嗅覺系統如何感知複雜多樣的氣味分子；二是我們的神經系統如何解碼氣味信號以形成不同的嗅覺感知。本文主要關注於第一個問題，跟大家分享幾十年來嗅覺受體結構研究的探索歷程。
探尋嗅覺受體
嗅覺是人體最早形成的感官之一，這是一種非常複雜的感官反應。通過數以百萬計的嗅覺神經，我們能夠感知和區分各種具有不同結構特性的小分子化合物，即氣味分子，即使濃度非常低 （微摩爾甚至納摩爾濃度範圍）。[2]
人體鼻腔黏膜中覆蓋着被稱為嗅覺上皮的組織，其中生長着大量嗅覺感覺神經元並相互連接。嗅覺感覺神經細胞通過纖毛延伸到鼻腔內的粘液層。我們聞到某種氣味的過程如下（圖1）：氣味分子進入鼻腔黏膜，被嗅覺感覺神經元的初級纖毛感知從而激活嗅覺神經細胞，併產生化學信號；這些化學信號觸發神經細胞產生電信號，然後通過嗅覺神經傳遞至位嗅球，再傳遞至嗅皮層（大腦負責嗅覺處理的皮層區域）。在嗅皮層中，大腦對傳入的嗅覺信息進行分析和識別。最終，嗅覺神經信號的處理形成了描述各種氣味的語義表徵，例如咖啡味、玫瑰味、芒果味，等等。
長期以來，嗅覺研究領域的一個關鍵問題是，細胞如何感受複雜多樣的氣味分子。一種合理的假設是，嗅覺感覺神經細胞上存在一種特殊的蛋白質，被稱為“嗅覺（氣味）受體”（Ordorant Receptor，OR），用於探測氣味分子。一直以來，科學家都在力求找到這些特殊的嗅覺受體蛋白。
20 世紀 80 年代中期，不同研究組進行的一系列生理生化實驗表明，氣味激活嗅覺感覺神經元是由 G 蛋白依賴性通路介導的。
G蛋白是細胞內非常重要的一類信號轉導分子，它通過與G 蛋白耦聯受體（GPCR）協同工作，將激素、神經遞質等各種信號因子產生的信號傳遞至細胞內，並進一步調節酶、離子通道、轉運蛋白以及其他各種蛋白的功能。在嗅覺神經元內，G蛋白介導腺苷酸環化酶的激活，細胞內環磷酸腺苷（cAMP）濃度的增加，cAMP門控離子通道的激活和神經元去極化[4]。
同一時期，一些嗅覺特異基因相繼被克隆，其中就包括編碼 G蛋白和 cAMP 門控離子通道的基因，進一步證實了 G蛋白信號通路在氣味信號轉導中的重要作用，這些研究強烈暗示嗅覺受體很可能是G 蛋白耦聯受體（GPCR）。
1991年，Linda Buck 和 Richard Axel 在Science雜誌上發表了一項開創性的研究工作——首次從大鼠中克隆並鑑別了嗅覺受體GPCR基因家族[6]。通過進一步的分析，他們還證明這些受體只在大鼠嗅覺上皮細胞中表達，而不在其他八個組織（包括大腦、視網膜和肝臟等）中表達。此外，為了估計嗅覺基因家族的大小，它們還進一步使用DNA的混合物作為探針，篩選大鼠基因組文庫。當時的篩選結果顯示，大鼠單倍體基因組包含至少 500-1000 個嗅覺受體基因。
Buck 和Axel隨後獨立地展開工作，進一步在人類嗅覺組織中發現了嗅覺受體GPCR基因的存在，並確認它們在人類嗅覺系統中的重要作用。
這些開拓性的工作，為我們理解和研究神秘的嗅覺感知奠定了重要基礎，由此兩人獲得了2004年度諾貝爾生理學或醫學獎。
2004年以後，人類基因組計劃的完成使得鑑定和分類人類嗅覺受體基因成為可能，進一步推動了嗅覺受體研究的發展。
現在，我們知道嗅覺受體主要是具有七次跨膜結構的G 蛋白耦聯受體（GPCR）。GPCR在人體裏面有超過800個家族成員，是真核生物中最大的細胞表面受體家族，它們參與了人體幾乎所有生命活動的調控。正因如此，GPCR成為了科學研究的“明星分子”和藥物研發的重要靶標。在美國食品藥品監督管理局（FDA）批准的所有藥物中，約三分之一通過靶向調控不同GPCR的活性來發揮作用[7]。而在人體所有的GPCR中，約有400個成員被歸類為嗅覺受體，佔據了GPCR成員的一半，是其中最龐大的蛋白家族。
嗅覺受體結構解析的困境
自1991年首次發現嗅覺受體以來，結構生物學家一直致力於解析嗅覺受體的結構，以闡明其識別氣味分子的機制。然而，近30年以來，嗅覺受體結構的解析工作進展並不順利，面臨諸多挑戰。
首先，大部分人類嗅覺受體主要在鼻腔神經細胞中表達，且表達水平較低。因此，直接在人源的組織樣本中很難獲得足夠量的蛋白（通常是毫克量級）用於結構解析工作。而異源表達（在動物細胞或細菌中表達）的效果也不理想， 不僅表達水平非常低，還會由於錯誤摺疊導致不具備生物活性。
第二，為了解析GPCR的蛋白結構，我們需要結合一些特定的高親和性的配體分子，也就是合適的氣味分子。然而，由於氣味分子巨大的化學多樣性，以及嗅覺受體的成員眾多，目前尚缺乏一種高效的方法來確定一個給定的嗅覺受體與哪些氣味分子相互作用。
現在學術界逐漸認識到，每個嗅覺受體可以與所有潛在氣味分子的一個子集相互作用，一種氣味分子可以激活多個嗅覺受體，不同受體對不同氣味分子具有不同的親和力。這種相互作用的複雜性導致大量的嗅覺受體並未找到合適的氣味分子配體，這些受體被成為“孤兒受體”（ orphan receptors ）[8]。目前很多“脱孤”的研究工作正在進行，開發有效的篩選方法，為孤兒受體尋找合適的配體。此外，由於大多數揮發性氣味分子是疏水性分子，溶解度很低，這大大增加了氣味分子配體的製備難度。
第三，作為細胞膜上進行信號感受和轉導的重要分子，GPCR是高度動態的蛋白分子，它在非激活、半激活、激活以及和不同調控分子耦聯等各種構象中不斷變化。因此，和其他大多數GPCR類似，嗅覺受體純化的一個難點在於穩定受體蛋白處於特定的構象，而這對於蛋白晶體的形成非常重要。
近年來，多個研究組相繼開發了很多的方法去穩定GPCR的不同構象，包括但不限於通過穩定性突變法獲得穩定性高的受體突變體用於蛋白結晶；通過結合“迷你 G 蛋白（miniGs）”來穩定與G蛋白耦聯的GPCR完全活性狀態下的結構；結合高親和性小分子配體（包括激動劑、拮抗劑、反向激動劑等）；開發新型納米抗體（Nanobody）來穩定GPCR不同複合物構象等。對於一個特定的GPCR而言，需要嘗試很多不同的方法去穩定特定的構象，這是一個非常耗時費力的過程。
曙光初現：從昆蟲到人
如今，結構生物學已經從晶體衍射跨入冷凍電鏡的時代。在一個完整的單顆粒冷凍電鏡技術中，純化過的蛋白被瞬間凍結在一層薄薄的非結晶玻璃體冰中，再經由透射電鏡成像，記錄下幾十萬到幾百萬個蛋白顆粒數據——用於三維重構和精確建模（圖4）。與傳統的晶體學手段相比，單顆粒冷凍電鏡技術（Cryo-EM）在解析生物大分子高分辨率結構方面具有明顯優勢，例如無須獲得晶體、所需樣品量小和樣品製備方式多樣等，且已被廣泛應用於解析GPCR與下游蛋白的複合物結構，這為嗅覺受體結構的解析帶來了曙光。
2018年，美國洛克菲勒大學Ruta實驗室的研究人員以近3.5 Å 的分辨率解析了一種寄生黃蜂的氣味輔助受體Orco 的單顆粒冷凍電鏡結構[9]。與哺乳動物不同，昆蟲氣味受體不是GPCR，而是門控離子通道，是由氣味受體OR和高度保守的輔助受體 Orco 組成的異多聚體離子通道。這個離子通道如同一個帶電粒子流過的孔，只有當受體遇到它的目標氣味分子時才會打開，從而激活嗅覺感覺細胞。長期以來，科學界對於Orco 是否可以作為獨立的嗅覺受體發揮功能存在爭議，並沒有形成統一的昆蟲氣味感受和信號轉導模型。這項工作首次展示了昆蟲氣味輔助受體Orco同源四聚體的精細結構，為確定 “昆蟲嗅覺輔助受體Orco可以形成一類新型異聚配體門控離子通道”提供了結論性的證據，得到結構解析並確認了其功能，為理解昆蟲周圍嗅覺機制提供了重要的新見解。
2021年，同樣來自Ruta實驗室的另一項研究工作解析了一種石蛃（Machilis hrabei）的嗅覺受體OR5的冷凍電鏡結構[10]（圖5）。通過比較OR5結合三種不同氣味分子的結構，研究者發現氣味分子結合主要依賴於疏水相互作用，缺乏其他經常介導配體識別的分子間作用力（如氫鍵）所固有的嚴格的幾何約束。
疏水相互作用是一種穩定蛋白質三維結構的作用力，通常發生在兩個或多個非極性氨基酸殘基中。當它們處於極性環境（最常見的是水）中時，對水的“厭惡”導致它們以某種方式相互靠近，以便儘可能少地與極性環境相互作用。這種非特異的弱相互作用為解釋“一種嗅覺受體為何可以識別不同的氣味物質”提供了一種新的機制，有別於其他許多受體配體相互作用的經典“鎖與鑰匙”模型。但OR5受體的非特異性並不意味着它沒有偏好性，儘管它可以結合許多不同的氣味分子，但也對很多其他的氣味分子並不敏感。此外，如果對一些結合口袋中的氨基酸進行簡單突變，即重新改變受體，受體則可以結合原本不喜歡的分子。這個發現也有助於解釋昆蟲為何能夠在進化過程中通過突變進化出數百萬種氣味受體，以適應它們遇到的各種生活環境，形成獨有的生活方式。
以上這些關於昆蟲嗅覺受體的結構生物學研究為我們理解氣味識別機制帶來了很多新的認識，但人和昆蟲畢竟是不同的，我們迫切需要人源嗅覺受體的高分辨率結構以揭開人體嗅覺感受的“面紗”。
直至2023年3月，Nature雜誌發表的一篇文章首次為我們揭示人體嗅覺受體結構的奧秘[11]。
在這項工作中，研究者選擇了被稱為OR5E2的嗅覺受體。他們之所以選擇這種受體，是因為它不僅在嗅覺神經細胞中表達，也在其他非嗅覺器官如前列腺中表達，這表明其更易於在異源系統中表達。也就是説，更易獲得足夠的蛋白。
這種受體的匹配分子也很容易獲得。前期研究已經表明這個受體可以結合並響應水溶性的短鏈脂肪酸（short chain fatty acids, SCFAs）氣味分子——丙酸。短鏈脂肪酸是腸道菌羣產生的一類信號分子，容易揮發，有特殊的刺激性氣味，並在許多疾病的發生、發展中起重要作用。
此外，OR5E2在進化過程中較為保守，可能是因為它們識別了對許多物種的動物生存至關重要的氣味，研究者推斷這種嗅覺受體可能在進化上更多地受到穩定性的約束。
簡而言之，通過這些策略，研究者巧妙地規避了大多數嗅覺受體低表達水平，大多數揮發性氣味劑的低溶解度和純化嗅覺受體高度不穩定性的挑戰。通過融合表達迷你G蛋白，以及結合Gβ1γ2 蛋白和納米抗體Nb35等策略，研究者穩定了OR5E2和丙酸結合的一種激活狀態，並利用冷凍電鏡解析了其三維高分辨率結構（圖6）。
在這個結構中，OR51E2 受體將氣味分子丙酸鎖在一個很小的閉合結合口袋中。在這個小口袋中，丙酸通過兩種類型的相互作用與 OR51E2 結合：極性相互作用（氫鍵和離子鍵），以及非特異性的疏水相互作用。因此，OR51E2 結合氣味分子的方式不同於昆蟲氣味門控離子通道，似乎選擇性更強。
許多嗅覺受體能夠對各種化學性質不同的氣味劑做出反應，而OR51E2似乎只與短鏈的脂肪酸結合。那麼是什麼因素決定了這種選擇性呢？對此結構的進一步分析表明， OR51E2 對短鏈脂肪酸的選擇性源於封閉結合口袋的體積（31 Å ），它可以容納短鏈脂肪酸，例如乙酸和丙酸，但是會阻止更長的脂肪酸鏈結合。因此，研究人員認為結合口袋的體積是氣味分子的重要選擇性因素。
作為第一個發表的人源嗅覺受體和氣味分子配體結合的激活態結構，這是一個令人欣喜的研究成果，它讓我們第一次直觀地看到氣味分子是如何與嗅覺受體結合的，儘管它在諸多方面並不完美，比如受體和G蛋白的耦聯。
配體與GPCR的結合通常會引起構象變化，從而使 G 蛋白耦聯，進一步將信號傳遞給G蛋白。在生理條件下，哺乳動物嗅覺受體可以與兩個高度同源的G蛋白Gαolf和Gαs結合。而在這個結構中，研究者並沒有耦聯Gαolf或Gαs，而是採用融合表達miniGαs，以及結合Gβ1γ2 和納米抗體Nb35穩定了受體和G蛋白異三聚體的結構。儘管發現了一些嗅覺受體和G蛋白的相互作用，但這並不足以解釋和體內真正的G蛋白Gαolf和Gαs的相互作用機制。
2023年5月24日，山東大學基礎醫學院孫金鵬實驗室在Nature雜誌在線發表了一項工作，系統解析了小鼠痕量胺嗅覺受體TAAR9（mTAAR9）識別4種內源性胺類配體（苯乙胺，二甲基環己胺，屍胺，亞精胺）並與下游Gαs及Gαolf蛋白耦聯的結構[12]。
痕量胺相關受體（trace amine-associated receptor， TAAR）是脊椎動物中進化保守的一類G蛋白偶聯受體，可以感受納摩爾濃度的痕量胺（trace amine）。痕量胺是由氨基酸脱羧形成的，對於在動物來説，它可作為感受一系列刺激的氣味分子，如判斷捕食者或獵物的存在、交配伴侶的接近和食物的變質，並根據氣味引起種內或種間吸引或厭惡的反應。近年來，越來越多的研究表明人體內痕量胺與多種精神紊亂相關，TAAR也因此成為精神分裂症、抑鬱症和藥物成癮等精神疾病潛在的治療新靶點。
在這項研究中，研究人員發現嗅覺受體TAAR在N端和第二個胞外段之間形成了一對二硫鍵，這在其他已知結構的GPCR受體中從未發現過，而且這對二硫鍵對於mTAAR9識別配體及穩定受體激活態的胞外構象至關重要。
單個TAAR嗅覺受體可以識別多種胺類氣味分子，而同一種胺類氣味分子也可以被多個嗅覺受體識別，這種相互作用的複雜特性是嗅覺感受胺類分子的重要基礎。這項研究發現了mTAAR9識別胺類氣味分子的通用結構基序以及識別不同胺氣味分子的組合結構基序，為胺類氣味分子識別提供了新的見解。
值得注意的是，研究者還解析了mTAAR9受體與兩種下游G蛋白Gαs和Gαolf耦聯的分子結構。作為第一個實驗確定的嗅覺受體和Gαolf的複合物結構，這為下游G蛋白耦聯後哺乳動物嗅覺受體完全激活提供了重要的認識。
未來的挑戰
在冷凍電鏡的加持下，嗅覺受體結構解析工作已經初見端倪，更大的挑戰也隨之而來。
以上結構揭示的只是一種激活態構象，但在生理狀態下，嗅覺受體是高度動態的。隨着人工智能在蛋白結構預測領域的高度發展，研究者也試圖通過計算機模擬展示受體的動態變化以完善理論模型，但這並不能完全等同於真實生理狀態下的結構變化。我們需要解析更多嗅覺受體不同時間動態下的結構，以及開發高分辨率的受體蛋白動態監測方法，來幫助我們打開完整的嗅覺感受的生物“黑匣子”。
近年來，隨着測序技術的不斷發展，在更多的非嗅覺組織中也發現了嗅覺受體的表達，包括心臟、呼吸道、腎臟、肝臟、肺、皮膚、大腦等部位。這些嗅覺受體在非嗅覺組織中的表達既有普遍性，又有特異性。有研究表明鼻腔外表達的嗅覺受體在特定的組織中具有特定的生物學功能[13]。一些研究發現，嗅覺受體的功能異常與神經系統疾病和腫瘤等疾病的發生和發展有關。解析這些受體在非嗅覺組織中的生理結構，為嗅覺受體結構研究提供了新的方向和挑戰，這些嗅覺受體將來也有望成為重要的藥物靶標。
回到本文最開始的那個問題：我們的嗅覺系統為什麼能感受並辨別如此複雜多樣的氣味？在科學上，目前我們還是不能完整回答這個問題，並且當我們對嗅覺受體結構的研究更多、理解更深的時候，這個問題似乎變得更為複雜了。嗅覺受體如何選擇性地對空氣中的氣味分子做出反應，只是更大的氣味難題的一部分，研究人員仍然面臨更為複雜的挑戰：瞭解大腦如何將受體傳導的電化學信號轉化為氣味的感知。
理解嗅覺感知的奧秘，我們還有很長的路要走。
參考文獻
[1] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28424010/
[2] https://academic.oup.com/nar/article/50/D1/D678/6362078
[3] https://www.ingentaconnect.com/content/ben/cn/2019/00000017/00000009/art00010
[4] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK55985/
[5] https://www.science.org/doi/10.1126/
[6] https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1840504/
[7] https://www.nature.com/articles/nrd.2017.178
[8] https://zh.wikipedia.org/wiki/%E5%AD%A4%E5%84%BF%E5%8F%97%E4%BD%93
[9] https://www.nature.com/articles/s41586-018-0420-8
[10] https://www.nature.com/articles/s41586-021-03794-8
[11] https://www.nature.com/articles/s41586-023-05798-y
[12] https://www.nature.com/articles/s41586-023-06106-4
[13] https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0055368
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