我國科學家首次構建胚胎幹細胞嵌合體猴

中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心網站消息，2023年11月9日24點，《Cell》期刊以封面文章的形式在線發表題為《Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells》（高比例胚胎幹細胞貢獻的出生存活嵌合體猴）的研究論文。該研究由中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心（神經科學研究所）、上海腦科學與類腦研究中心劉真研究組、腦智卓越中心非人靈長類研究平台孫強研究團隊和中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院Miguel A. Esteban研究組合作完成。該研究在國際上首次成功構建了高比例胚胎幹細胞貢獻的出生存活嵌合體猴，並證實了猴胚胎幹細胞可以高效的貢獻到胚外胎盤組織和生殖細胞。這對於理解靈長類胚胎幹細胞全能性具有重要意義，為遺傳修飾模型猴的構建奠定了技術基礎。

胚胎幹細胞是指由着牀前囊胚的內細胞團在體外分離培養而來的多能性細胞，在模式動物構建、細胞治療、器官再生、類器官模型等生物醫藥領域發揮着重要作用。胚胎幹細胞具有體外無限自我複製更新、誘導實現多向分化、胚胎注射形成嵌合體等關鍵特徵，其中胚胎注射形成嵌合體被公認為是評估胚胎幹細胞多向分化潛能的金標準。

小鼠胚胎幹細胞注射到囊胚並形成嵌合體的技術是構建遺傳修飾小鼠模型的關鍵技術。1984年首次實現小鼠胚胎幹細胞胚胎注射形成嵌合體，2008年成功實現大鼠胚胎幹細胞胚胎注射形成嵌合體。建立非人靈長類胚胎幹細胞嵌合體技術對於生物醫藥研究具有非常重要的意義，然而非人靈長類胚胎幹細胞嵌合體研究一直進展緩慢。

該研究的首要問題在於獲得具有高效發育潛能的胚胎幹細胞。針對這一問題，研究團隊建立了處於6種不同培養體系下的食蟹猴胚胎幹細胞，進而從克隆形態、免疫熒光、單細胞轉錄組、線粒體代謝、全基因組甲基化、核型分析和全基因組測序等多方面對處於不同培養條件下食蟹猴胚胎幹細胞進行全面系統的評估。發現5iLAF、4CL和PXGL體系下培養的食蟹猴胚胎幹細胞具有較高的多能性，而且4CL體系下的幹細胞具有更好的傳代穩定性和基因組穩定性。

胚胎幹細胞注射入受體胚胎後的快速凋亡是影響胚胎幹細胞成功嵌合的關鍵。研究團隊選用綠色熒光蛋白標記的4CL條件下的胚胎幹細胞進行猴胚胎注射實驗，通過測試幹細胞注射入胚胎後的不同培養基和培養時間的組合，最終得到了既不影響胚胎正常發育又能保證幹細胞存活的最優嵌合胚胎培養條件。而且5iLAF和Primed體系下的胚胎幹細胞在該優化條件下也表現出胚胎注射後的高存活率。將注射了4CL和5iLAF幹細胞的嵌合胚胎分別在體外延遲培養到第17天，發現注射的胚胎幹細胞仍然可以高效存活，單細胞測序表明猴胚胎幹細胞可以與受體胚胎細胞同步發育，並且貢獻到第17天猴胚胎的不同細胞譜系中。

在系統性評估了不同培養條件下猴胚胎幹細胞狀態和改進優化了嵌合胚胎培養條件的基礎上，研究團隊進一步將注射了綠色熒光標記的4CL幹細胞的胚胎移植到代孕母猴。在總共得到的10只出生或流產的仔猴中，有一隻出生存活猴和一隻流產猴檢測到胚胎幹細胞的嵌合。研究團隊建立了包含PCR擴增、微衞星親子鑑定、基因組單核苷酸多態性深度測序、流式細胞儀檢測、綠色熒光蛋白檢測、免疫熒光檢測的一系列嚴格的嵌合體分析流程，發現出生存活猴中胚胎幹細胞的貢獻比例高達70%左右，流產猴中胚胎幹細胞的貢獻比例約20%。單細胞轉錄組測序也進一步表明了注射的胚胎幹細胞可以跟受體胚胎細胞同步分化到出生個體猴的各種不同細胞譜系中。

胎盤組織和生殖細胞是胚胎髮育和重編程過程中的兩類特殊組織或細胞。其中胎盤組織是由滋養外胚層發育而來，而生殖細胞發育過程中要經歷更加劇烈的表觀重編程。研究團隊在兩隻嵌合體猴的胎盤組織中均發現了胚胎幹細胞的高比例貢獻。考慮到小鼠胚胎幹細胞幾乎不會貢獻到胎盤組織，該結果説明靈長類胚胎幹細胞可能具有不同於齧齒類的獨特的發育全能性特徵。此外兩隻嵌合體猴的生殖細胞中也發現了胚胎幹細胞的高比例貢獻，這對後續基於該技術的遺傳修飾模型構建至關重要。

該工作建立了系統評估不同培養條件下猴胚胎幹細胞的多能性狀態的研究體系，並探索得到有利於胚胎幹細胞存活的胚胎嵌合體的培養條件，顯著提升了胚胎幹細胞注入胚胎後的存活效率，最終得到了出生存活的高比例胚胎幹細胞貢獻的嵌合體猴，證實了注入的猴胚胎幹細胞可以高效地貢獻到包括胎盤和生殖細胞在內的各種不同組織和細胞。該研究對於理解靈長類胚胎幹細胞全能性和發育潛能具有重要意義，為建立基於猴胚胎幹細胞嵌合體的基因打靶和模型構建技術奠定了基礎。

該研究嚴格遵守生物倫理規範，所有實驗均符合國際幹細胞研究學會的研究指南，並經過腦智卓越中心倫理委員會審核。中國科學院腦智卓越中心劉真研究員、孫強研究員和中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院Miguel A. Esteban研究員為該論文共同通訊作者。中國科學院腦智卓越中心、西北農林科技大學聯合培養博士研究生曹靜、腦智卓越中心副研究員李傑、助理實驗師李春楊、中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院副研究員李文娟、Md. Abdul Mazid、博士研究生賈雯淇、吉林大學博士研究生薑禹為該論文共同第一作者。該研究還得到了腦智卓越中心蒲慕明院士、西北農林科技大學王小龍教授、華大生命科學研究院徐訊研究員和劉龍奇研究員、劍橋大學Patrick Maxwell教授、以及腦智卓越中心、廣州健康院、華大生命科學研究院多位合作同事的大力支持。該研究得到了腦智卓越中心光學成像平台和分子細胞技術平台的技術支撐。該研究獲得了科技部、中國科學院、上海市、基金委的資助。

 

　　圖1.不同培養條件下猴胚胎幹細胞中SOX2，NANOG和KLF17的免疫熒光。　  

　　  

　　圖2.不同細胞注射的嵌合胚胎體外延遲培養效果圖。

　　  

　　圖3. 非人靈長類胚胎幹細胞嵌合體研究模式圖。

　　  

　　圖4. 胚胎幹細胞嵌合體猴卡通寓意圖被選為該期Cell雜誌的封面。

　　  

　　圖5. 胚胎幹細胞嵌合體猴研究團隊主要成員（左起：李傑、曹靜、劉真、孫強、李春楊）