出門住個店，居然巧遇一個新物種！_風聞

今天，楊毅老師給我們帶來了一個發現新物種的故事。2018年，在浙江長興縣，發現了長興原指樹蛙（Kurixalus inexpectatus），發現的過程頗為曲折，其中還夾雜着一些機緣巧合。

故事的緣起是南京林業大學生物與環境學院副教授Kevin Messenger想找角蟾亞科（Megophryinae）的最北新分佈，而時任梨花女子大學博士後的Amaël Borzée想找依賴水稻田繁殖的無斑雨蛙（Dryophytes immaculatus）（想看這個物種的故事，你還可以讀《尋找中國最後的無斑雨蛙！》）。

於是二人在2018年的4月底，到兼有丘陵（角蟾棲息地）和平原（雨蛙棲息地）的江浙兩省交界地區聯手考察，我作為Kevin的助理加入了考察隊伍。結果無心插柳柳成蔭，兩位老師都未找到目標種，卻在浙江省湖州市長興縣發現了一個新物種。

故事開始的地方

為了節約科研經費，我們的司機鵬常喜師傅找了一家度假村住宿，卻意外把我們送到了樹蛙新物種面前。 

度假村坐落於湖州市西北郊一處丘陵東南緣，海拔不到100米的平緩山谷，一條溪水從深山竹林中淌出，穿越2千米度假村的範圍後流入平原田野，滋養尋常百姓。我們都感慨這條溪水的清澈，形成水潭的地方甚至映出翡翠色。當時主打有機無公害的度假村對草坪、人工林地、菜地、茶園、桃園和荒地等均採用零農藥。

山谷東北側的山坡長着次生天然林，物種以茶（Camellia sinensis）、鹽麩木（Rhus chinensis）、茅慄（Castanea seguinii）、山胡椒（Lindera glauca）、黃檀（Dalbergia hupeana）、木蠟樹（Toxicodendron sylvestre）、白背葉（Mallotus apelta）、高粱藨（Rubus lambertianus）、竹（Bambusoideae）等為主，在以連片竹海為主導植被的該區域難得一見。當晚發現的長興原指樹蛙新種就在這片次生林山腳。

度假村內溪水潭及北側山坡的次生雜樹林，茶、鹽麩木、茅慄、山胡椒、黃檀、木蠟樹、白背葉、高粱藨、竹等構成羣落，長興原指樹蛙就在籬笆外山腳的積水處繁殖 ©楊毅

夜探正片開始

白天視察過生境後，當晚下起温潤的暮春小雨，正是蛙類出沒的時節，Kevin、Amaël和我繼續探索山谷。Kevin聽到了陌生的動物鳴叫。Kevin自2006年起，幾乎每年都來中國，腦海中積累了許多中國蛙鳴樣本，但這回聽到的聲音令他毫無頭緒，僅能憑直覺判定是蛙叫。

於是Kevin叫上Amaël和我，沿着平行於溪水的土路向着聲音源頭尋覓，往上游方向走了百來米後踩着河牀水淺裸露的部位過河，從對岸的鐵絲圍欄下鑽了出去，來到一條土路上，窸窣的單音節口哨聲就從土路對面的灌叢中發出。

楊毅老師畫的地圖，最初探測到長興原指樹蛙的地點，追溯鳴聲源頭的路線 ©楊毅

於是我們貓着腰找了半天，終於Kevin在離地面20釐米高的細枯枝上找到了發出聲音的東西——一隻褐色的，皮膚帶有疣粒，體長僅3釐米的蛙。從它（手）指端和（腳）趾端膨大的吸盤，以及抓握攀援的行為，我們判斷其屬於樹蛙科（Rhacophoridae）。

在低矮的枯枝上，我們終於找到了這隻發出不明聲音的蛙——第一隻長興原指樹蛙 ©Kevin Messenger

接下來我們又找到了3只個體，儘管灰頭土臉缺乏鑑別特徵，Kevin和Amaël憑藉經驗推測其為原指樹蛙屬（Kurixalus）或稜皮樹蛙屬（Theloderma）的物種，而回去一翻圖鑑對照形態便排除了後者，認定了是原指樹蛙屬。其實從行為上，我們也可以排除在積水樹洞中繁殖的稜皮樹蛙，因為此處的生境是山麓林緣的車軋印積水，所以應當是雄性原指樹蛙在這裏求偶鳴叫，吸引雌性前來交配並在水坑裏或附近產卵，孵化後的蝌蚪在露天開放水體中發育至變態。

長興原指樹蛙繁殖生境，同時也是許多樹蛙和其他蛙類物種共享的繁殖生境 ©BSGStudio、楊毅

幾步之遙外，也利用林緣積水繁殖的大樹蛙（Zhangixalus dennysi），將米黃色的卵粒產在一坨泡泡中懸於積水上方，這坨卵泡連同折斷的樹枝一起落水了，泡泡能防潑水但不耐受浸沒，所以我們將其掛回了樹上，不然卵會淹死 ©Amaël Borzée

就在這窪水和卵泡上方的梢頭，我們找到了大樹蛙本尊，很可能是它產下的卵  ©Amaël Borzée

不管是哪個屬，它們都很像東南亞的物種，不像是會分佈在北緯31°華東地區的物種。於是Amaël用棉籤拭子採集了每隻個體的唾液，準備以後用PCR（聚合酶鏈式反應）技術進行遺傳物質鑑定，隨後將蛙原地放歸。

Amaël使用非侵害的採樣方式，用拭子採集樹蛙唾液用於分子鑑定，沒有蛙願意嘴裏被插入棉籤攪拌（但相信它們更不願意被切除腳趾、大腿肌肉或肝臟），越小的蛙越難操作 ©Kevin Messenger

採集模式標本

為期3天的考察結束，壞消息是沒有找到角蟾或雨蛙，好消息是分子鑑定結果顯示我們發現的待定樹蛙，與基因庫裏的任何物種都不吻合，與之親緣關係最接近的是分佈於中國台灣省的面天原指樹蛙（Kurixalus idiootocus），即我們發現了原指樹蛙屬的一個新物種。

面天原指樹蛙與我們在浙江北部發現的未知物種的遺傳關係最為接近 ©莊銘豐

接下來，要發表並命名這一新物種，使之成為學術界“公認合法”的物種，就需要三件事：

第一，採集模式標本（type specimen），作為實物憑證供其他科學家參考和驗證，以確保科研數據的準確性和可重複驗證性。第二，對其形態學、遺傳學等方面進行研究，並與已知的近緣種比較（差異）。第三，產出確鑿數據後撰寫描述新種的論文，投稿至領域適合的學術期刊，通過同行評審後接收發表。

分類學vs物理學模式，三個小鬼代表模式標本，其中最黑的是正模標本，模式標本正常要採不止一頭，但正模必須有且只有一頭，作為對該物種的直接定義 ©楊毅

鑑於人口稠密的長三角如果存在新種，那麼它應當極度罕見或狹域，採集標本、殺死個體可能會對本就脆弱的種羣造成危害。Amaël為了保護動物，希望用3D掃描技術代替傳統的模式標本，來保存該種原指樹蛙的形態特徵。然而用這種技術來進行新種描述還太新穎，Amaël諮詢了若干家學術期刊，均得到否定答覆，所以為了讓學術界承認該物種，我們只得按部就班地採集模式標本。

Scott Trageser用四台Sony RX0 II相機制作的，長吻斑蟾（Atelopus longirostris）的虛擬3D掃描影像，國際自然保護聯盟（IUCN）一度將這種蛙列為滅絕，直到2016年在厄瓜多爾被重新發現 ©Scott Trageser

於是，在2018年7月4日，趁伏旱到來前，鵬師傅和我回到先前發現原指樹蛙新種的地方，再次入住同一處度假村，目標是採集10只模式標本（最好包含雌雄及各生活史階段的個體），錄下鳴聲［長得很像的動物，可能實際上並不是一個種，這種情況稱為隱存種（cryptic species），叫聲是一個很好的分辨方式］，記錄生態習性，並嘗試尋找周邊潛在種羣。

7月初的浙北處於梅雨末期，經過（一年中降水量最大的）6月的大量降雨，在原指樹蛙棲息的山麓，積水早已高過了車轍印，徹底淹沒了平緩的小路。

7月初的長興原指樹蛙模式產地（type locality）生境，積水淹沒了小路，灌叢野蠻生長，聽見和看見蛙的難度是兩個級別 ©楊毅

我們白天在度假村對面的村民家吃飯，午後暴雨如注，村民得知我要晚上穿涼鞋找蛙，痛心疾首地勸説這裏毒蛇多，得穿高筒靴。主人更是瞪得眼如銅鈴，比劃籃球粗的巨蟒，“爬行起來樹葉沙沙作響，估計是百年蛇精”，在場者皆聽得兩股戰戰。我勉強忍住沒笑。

當晚下着小雨，我在日落後沿度假村北邊界圍牆外的山麓土路走，樹、草叢隨處傳來中國雨蛙（Hyla chinensis）清脆的呱聲。我來到了一個很大的水窪前，沿路長達8米，深達15釐米以上，開始聽到連綿不絕的急促口哨聲，我相信它就是我要找的目標了。

次生林山麓土路最大的一處水窪 ©楊毅

由於物理環境的變化（低温少雨vs高温多雨）以及潛在的種內雄性間競爭加劇，相比於4月底，7月初的原指樹蛙叫得更活躍，數量更多。 

2018年4月底（上）與7月初（下）長興原指樹蛙鳴聲語圖 （縱軸表示頻率，單位赫茲；橫軸表示時間，單位秒；顏色表示信號強度）對比，後者單位時間內的音節數更多，注意前者包含兩隻個體的鳴聲 ©楊毅

然而經過兩個多月，植被也長得更為茂盛，儘管聽到不少蛙叫，但透過灌木叢視覺搜尋的難度也大大增加。這蛙甚是警覺，被光照到便停止鳴叫甚至逃逸，好容易看到一隻還得伸手去抓，人觸動枝條或伸手接近蛙便受驚跳走。這片小樹林遍佈帶刺的藤本植物高粱藨，沒一會兒我的雙臂就被劃得火辣辣的，努力一晚上僅抓到6只活體。

第二晚我九點半才去採集，蛙鳴寥寥無幾，我猜是因為樹蛙的活躍高峯是黃昏或下小雨時，而現在天色已晚，雨也剛停。我嘗試用引起蛙類發出鳴聲慣用的playback方法，播放剛剛錄到的叫聲，期望雄蛙聽到同類鳴聲後為了保護資源（領地、配偶）發出鳴聲作為（競爭性質的）回應，但收效甚微。

鳴叫求偶的雄性長興原指樹蛙，棲息在帶刺植物高粱藨上是個反人類的好策略 ©楊毅

第三天黃昏再次大雨傾盆，接着減弱到小雨，儘管蛙鳴不如第一晚多，但順利抓到了足夠的蛙。我走完了度假村北邊界的土路，一共發現至少五處原指樹蛙主要的繁殖水坑，均是沿路最豐沛的幾處水體。

經過三個晚上的努力，我一共採集到12只成年雄性個體。我將它們臨時裝在戳了透氣孔的塑料瓶裏，塞入潮濕的枯枝落葉，放進廁所，而不是開着空調的卧室，後者濕度會被空調降得過低，不利於蛙的生存。

我們也嘗試搜尋長興縣和宜興市周邊潛在分佈的種羣，特別是尋找類似的林緣積水生境，但由於天氣多雨和行程時間太緊，沒有新發現，詢問當地人哪裏有這種生境或樹蛙也沒有得到結果。粗略考察江浙皖三省交界的森林，幾乎是清一色的竹海，林下空曠，缺乏為原指樹蛙提供棲息庇護的植被。

長興縣的竹林，林下空曠，缺乏能讓原指樹蛙棲息的灌叢 ©鄧可

儘管Amaël相信江蘇一側也應當有該樹蛙分佈，但截止到我寫作本文時，尚未聽聞相關發現報道，只有中國科學院成都生物研究所的鄧可博士在模式產地以西2千米處（相隔一條分水嶺）的三個位點零星聽到幾隻鳴叫，均位於竹林下有稀疏灌叢的地方 。 

後期研究與論文撰寫

原指樹蛙屬不同的物種在形態和生態方面都比較近似，然而，同種的個體或在不同環境下卻有明顯可見的差異。也就是説種間差異不大，種內差異不小，所以它的分類相當困難。這種情況下，分子生物學能提供額外的遺傳信息數據，重建物種之間的系統發育關係。現代分類學越來越多地採用整合的分類方法，將形態、分子、生態等多種信息結合起來，以獲得更全面和準確的分類結果。

模式標本已經採集回屋，下一步要做的就是用遊標卡尺對其進行形態測量。查閲以往所有原指樹蛙屬物種命名的文獻，一共出現過18個形態指標，我們也測量本研究物種的18個形態指標。

蛙的形態指標示意圖；A：頭寬（HW）；B：頭體長（SVL）；C：脛長（TL）；D：眼間距（IOD）；E：頭長（HL）；F：眼徑（ED）；G：鼻間距（IND）；H：眼鼻間距（EN）；I：足長（FL）；J：鼓膜徑（TD）；K：股長（THL）；L：吻長（SL）；M：手長（HAL）；N：前臂長（FLL）；O：眼瞼寬（UEW）；P：第3指吸盤寬（Fin3DW） ©Watters et al.

通常分類學家拍好青蛙新物種的生態照後，就會將其泡入70%酒精溶液定形制成標本，然後測量形態及取下肝臟或大腿肌肉做分子測序。但曾做過多年獸醫，寵愛動物的Kevin不願立即殺死蛙。他想保留活體飼養，直到樹蛙壽終再做標本，這樣沒準還能觀察到額外的生活史。

體型越小的蛙形態越難測，若活蹦亂跳則難上加難，所以Kevin準備了一瓶止痛藥，囑咐我滴一滴在蛙腹部，把它麻醉，趁其失去知覺的那段時間測形態。至於分子樣品，按Amaël的囑咐，每隻個體用三根拭子先後採集三次唾液。 

不料，麻醉後的蛙都沒有甦醒，數小時後身體甚至發出臭味——一滴止痛藥對這嬌小的樹蛙竟達到了致死量。Kevin吃驚，親自控制劑量塗了不到一滴在下一隻活的蛙腹部，這隻幸運的蛙在昏倒後不久甦醒過來。Kevin曾用該方法麻醉過比原指樹蛙體型大不了太多的角蟾。我們猜測，地棲物種普遍對化學污染耐受度相對高（儘管角蟾在地棲類羣中算是對水質環境敏感的物種），而樹棲物種皮膚更薄，更易吸收藥劑，導致原指樹蛙不幸丟了性命。

長興原指樹蛙同一個體深淺兩種形態對比，不被打擾時為通常的深色形態，被人抓住後約半小時漸變為淺色 ©楊毅

給如此小的蛙做形態測量對我是個痛苦的過程，我努力找尋每個指標的邊界並將測量爪與之相貼，每個個體的每個指標測三次取平均，確保數據準確，能為後人提供參考。

18個形態指標固然豐富，但其中許多變量間可能存在相關性，從而增加了數據分析的複雜性；如果單獨分析每個指標，可能會忽略變量之間的相互關係和共同變化模式。這種情況下就需要用主成分分析（PCA）對數據降維，將相關性強的變量合併成儘可能少的新變量，最終只保留兩個彼此正交的主成分。這樣，數據便壓縮到易於可視化和理解的二維空間中，同時保留了數據中最重要的信息。統計方法聽上去高端複雜，實則都是機械套路的操作。

由 PCA 得出的兩個主成分圖，顯示了長興原指樹蛙（綠色散點）與面天原指樹蛙（藍色散點）之間形態特徵的非聚類 ©Kevin Messenger 

長興原指樹蛙腹面胸口的兩大塊暗色斑也是一個形態鑑別特徵 ©林青松

蛙的廣告鳴叫（advertisement call）是一種種內通訊（intraspecific communication）方式，用於吸引配偶。每種蛙都會發出獨特的鳴聲，有助於形成交配前的生殖隔離（pre-mating reproductive isolation），從而促進物種的形成和維持。長興原指樹蛙的鳴聲分析交由國立中興大學的莊銘豐博士處理，他對中國台灣的幾種原指樹蛙具有豐富的研究經驗，並保存有它們的鳴聲錄音。

莊銘豐要做的工作是，將本研究物種與它最近的“親戚”面天原指樹蛙的廣告鳴叫屬性進行比對。我們選擇每回合鳴叫數（# of call in a bout）、回合時長（bout length）、音節間隔（call interval）、音節時長（call length）、主頻（dominant frequency） 等9個變量指標做種間比對，結果其中7個指標存在顯著差異。主成分分析的結果也可看到明顯的數據分離。

鳴叫中的面天原指樹蛙 ©莊銘豐 

基因測序由梨花女子大學的研究生Siti Othman操作分析，結果顯示長興原指樹蛙聚成一個單系，且與任何已知物種不構成單系，表明其有獨特的遺傳特徵；它與分佈於中國台灣省和琉球羣島的原指樹蛙物種構成一個支系，而分佈於東亞和東南亞大陸的大部分種類構成另一支系。

3.46百萬年前的上新世，台灣省和大陸之間由一座陸橋相連，原指樹蛙的祖先從華東南經該陸橋擴散到台灣省並定殖，然後在距今3.06百萬年前的上新世晚期到更新世，長興原指樹蛙與跟它最近緣的，台灣省的面天原指樹蛙發生分化，成為各自獨立的物種。接下來的地質史裏，地球經歷了多次冰期和間冰期的交替，造成華東南地區的大部分原指樹蛙滅絕，而江浙交界的長興由於未知原因成了原指樹蛙的避難所，使其成為了孑遺（relict）物種。 

根據未連鎖的12S rRNA和TYR基因重建的物種樹，星號（*）表示長興原指樹蛙，與其姊妹種台灣的面天原指樹蛙的譜系分化發生在3.06百萬年前的上新世晚期到更新世 ©Siti Othman

最後到了給新物種命名的環節。Kevin用inexpectatus作為這一新種的種加詞，意為意料之外（unexpected）。當初想找角蟾和無斑雨蛙時意外地發現了它，在人口稠密的長三角找到未被發現的脊椎動物，而且是個熱帶類羣，也是意外中的意外，從此將原指樹蛙屬的分佈範圍拓寬了663千米。

在學名命名中，種加詞和屬名如果都有性（別），應保持一致。原指樹蛙屬名Kurixalus以-us為後綴表陽性，所以種加詞inexpectatus後綴與之對應也表陽性。

科研中滿了隨機

不期而遇、採集標本、數據分析，研究一路都相當順利，同事們信誓旦旦地説“衝一波，準備在2018年聖誕節前投稿”。然而，由於種種事情拖延，我們在2020年底的聖誕假期，才終於把文章投到一個兩棲爬行學專刊。

在此時，突然一個“驚喜”從天而降，另有一支中國團隊，也在同一片山發現了這種原指樹蛙，而且還在進行描述！——氣氛一下刺激起來了，要知道一個新種一旦發表，相同物種的描述就不能再發表，捷足先登者名利雙收，而其他人的努力便成白費。

我們心驚肉跳地等候幾個月，稿件杳無音訊，追問後，編輯坦承雜誌社當前積壓了一年的來稿待審……

於是我們撤回，迅速修改格式後，於2021年7月改投了MDPI旗下的一個動物科學期刊。但審稿人的評價非常負面，目的純粹是要拒稿。期刊提出的要求，已經超出了描述新物種的範疇，但我們只得（咬着牙）按它的要求修改，增加了更高端全面的測序分析等成分。文章體量也大大膨脹，最終還是在當年底遭到拒稿。

好在，應系統動物學期刊Zookeys編輯邀請，我們在2022年稍改格式後投稿，儘管仍有一位審稿人不滿意，但只用了三個月，論文就被接收了。這時，離我們發現該物種已經過去了4年。

編輯的話：

讀到這裏的朋友，不知道有沒有注意到一個細節，楊毅老師發現新種蛙的度假村，採取“零農藥”的管理方式。兩棲類是受人類影響最為嚴重的動物類羣之一，目前全球近70%的兩棲類物種處於受威脅狀態。棲息地喪失是影響兩棲類種羣的最直接因素，此外，環境污染如殺蟲劑，也在破壞着它們所剩無幾的棲息環境。我編輯這篇文章的時候，楊毅老師告訴我説“那裏現在也噴點藥了”，這隻度過了三百萬年滄桑的小蛙，未來將如何呢？