8年，中國科學家突破性進展補上這一領域“最後一塊拼圖”

2016年1月，回國不滿半年的張餘，在《中國科學院分子植物科學卓越創新中心人員遴選申請書》裏寫道：“申請人擬開展的工作是運用結構生物學研究葉綠體編碼的RNA聚合酶（PEP）的工作機理和調控機制。”

當期封面。受訪者供圖

8年後，張餘團隊和華中農業大學副教授周菲團隊合作，解析了PEP的冷凍電鏡結構，並揭示了該葉綠體基因轉錄“機器”的“裝配部件”“裝配模式”“功能模塊”，為葉綠體光合作用的基礎研究和應用探索打下了基礎。相關研究成果3月1日以封面文章形式發表於《細胞》。

“植物學領域的前沿科學問題，很多都是生命科學的共性問題。”中國科學院院士、中國科學院分子植物科學卓越創新中心（以下簡稱分子植物卓越中心）主任韓斌告訴《中國科學報》，這項工作填補了RNA聚合酶（RNAP）領域的空白，是可以寫進教科書的突破性進展，將帶動後續一系列應用方面的探索。

領域裏最有挑戰性的難題

如果將細胞比作一台精密運轉的電腦，基因轉錄機器——RNAP則是轉錄過程中的“中央處理器（CPU）”，其重要性不言而喻。“遺傳信息被存儲在基因組這塊‘硬盤’中，必須藉助‘CPU’讀取細胞中的各類數據，並整合各方信號輸出指令，才能開始後續的生命活動。”張餘解釋。

隨着對此類“CPU”認識的不斷深入，人們驚奇地發現，儘管生物種類繁多，RNAP卻十分保守。

幾十年間，科學家陸續解析了細菌、古菌、真核生物RNAP的結構和工作機制。但對植物特有RNAP的解析進展緩慢。直到近幾年，張餘和分子植物卓越中心研究員王佳偉才合作闡明瞭植物特有的Pol IV結構和機制。而PEP結構遲遲不現“廬山真面目”。

事實上，僅PEP的鑑定發現就經歷了32年。原因在於其結構過於複雜。“這是一個持續發現的過程。可能某一年發現某一蛋白是RNAP的亞基組分，過兩年又發現了一個。”張餘説。

植物葉綠體的“祖先”是原核藍細菌。演化至今，葉綠體基因組變得“小而精”，轉錄葉綠體基因組的機器卻越發複雜。PEP在原核藍細菌基因轉錄機器的基礎上，裝配了多個獨特的功能模塊，“身形”變為原來的2.5倍，其“裝配部件”數量變為原來的3倍。然而這些模塊在原核藍細菌中基本沒有原型，大多數“借”於真核細胞。

多年研究表明，葉綠體基因轉錄機器控制葉綠體的發育過程以及成熟葉綠體的基因表達，在調控植物光合作用中發揮關鍵作用。“PEP研究是領域內最重要、最有挑戰性的。”王佳偉説。

科研是一場沒有硝煙的競爭

回國後的8年間，張餘團隊聚焦細菌、酵母和植物的細胞核與細胞器RNAP，持續產出成果。但對於PEP的結構解析，在很長的一段時間裏都沒有進展。

“最大的瓶頸是如何從葉綠體中純化丰度非常低的RNA聚合酶。我們嘗試了多種手段，都以失敗告終。”張餘回憶，“比如我們嘗試沿用解析Pol IV時的一個方法，用擬南芥懸浮細胞去純化植物內源蛋白，但目前擬南芥中葉綠體轉化的效率非常低，很難把穩定的蛋白標籤插入到葉綠體基因組中。”

2019年，德國馬普分子植物生理所所長、德國科學院院士Ralph Bock在分子植物卓越中心作學術報告時，介紹了其在植物質體轉化技術和應用領域的研究進展。張餘茅塞頓開，意識到可以在PEP的基因序列中加上一段DNA序列作為標籤，再通過親和純化的方式，把PEP從複雜的組分中“拉”出來，從而獲得葉綠體基因轉錄蛋白質複合物。

於是，團隊鎖定了葉綠體基因轉化效率較高的模式植物大葉煙草。“但是前期我們沒有種植煙草的經驗，剛開始種植就遇到了蚜蟲暴發，煙草一直長不大，我們不得不天天用透明膠帶手工捕捉蚜蟲。最後通過對温室和培養土滅菌才得以根治蟲害。”論文第一作者、分子植物卓越中心副研究員武霄仙回憶道。

直到2022年底，團隊才建立了穩定的純化流程，突破了PEP蛋白獲取瓶頸。然而，國際競爭十分激烈，陸續有幾個課題組在PEP純化及結構解析方面取得了突破。

“我們當時很緊張。”為了確保進度，武霄仙還沒休完產假就回到實驗室投入研究，經常做實驗做到半夜。而PEP複雜的結構給數據處理帶來了挑戰。在獲得蛋白冷凍電鏡結構後，武霄仙發現PEP蛋白的二維分類中存在很多“洞”和“犄角”，三維結構也很陌生。“文獻報道PEP由藍細菌RNAP進化而來，但是我找不到一點藍細菌RNAP的影子，一度以為自己解析了一個‘雜蛋白’。”

最終，團隊從較為熟悉的亞基入手，基於前期文獻和AlphaFold結構預測，將PEP亞基放置到了準確位置，並很快開始撰寫論文。

2023年6月，英國Michael Webster課題組在會議中報告了白芥PEP蛋白冷凍電鏡結構的相關進展。最後Webster課題組和張餘團隊商量“背靠背”共同發表。

“在這8年時間裏，我們之所以能夠堅持研究下去，得益於分子植物卓越中心營造的比較寬鬆、讓青年人才能夠潛心啃‘硬骨頭’的環境。”張餘強調。

補上最後一塊拼圖

與原核藍細菌基因轉錄機器相比，PEP一共具有20個“裝配部件”（蛋白亞基），其中14個是其特有的。張餘團隊發現，它們通過“套娃模型”進行裝配：藍細菌來源的催化模塊包含6個“裝配部件”，位於複合物的核心層；支架模塊由7個部件組成，位於中間層，一方面可以穩定催化模塊，另一方面為其他模塊提供結合位點；另有7個部件位於最外層，具有不同的功能特性。

在“套娃”最外層，分佈着3個不同模塊：保護模塊包括兩個蛋白亞基，保護PEP免受葉綠體中超氧化物的氧化攻擊；RNA模塊包括1個亞基，能夠序列特異性地結合RNA；調控模塊由4個亞基組成，可能參與基因轉錄機器的活性調控。其中，催化模塊由葉綠體基因組編碼，蛋白亞基起源於藍細菌；其他模塊由細胞核基因組編碼，大部分蛋白亞基起源於真核細胞，在細胞質翻譯後運輸至葉綠體完成組裝。

“這是一個非常巧妙的組裝模式，能夠保證細胞核控制葉綠體的基因表達。”張餘解釋，“這些亞基需要在細胞核中完成轉錄、在細胞質中完成翻譯，再運輸到葉綠體中，同催化模塊組裝成完整的複合物，此時PEP才能夠發揮功能。”

張餘指出，葉綠體基因轉錄機器結構被解析出來，意味着三域生物所有RNA聚合酶的結構類型均被闡明，“最後一塊拼圖”終於被補上。

該研究在基礎研究層面，為進一步探索葉綠體基因轉錄機器的工作模式、理解葉綠體的基因表達調控方式打下了基礎；在應用層面，為改造葉綠體基因表達調控網絡、增加光合作用複合物的基因表達、提高光合作用效率打下了基礎；在合成生物學應用層面，則可助力重組疫苗、重組蛋白藥物和天然產物的生產。

“我們只是把研究葉綠體基因轉錄領域的門推開了。在整個轉錄過程中，還有很多其他蛋白和小分子參與，需要在多個層面進一步開展研究。”張餘説。

（《中國科學報》見習記者 江慶齡，本文刊於《中國科學報》2024-03-01 第1版 要聞）