精準點突變細胞系構建：從原理到實操四大策略全解析_風聞

在高通量測序（NGS）日趨普及的當下，大量人類單核苷酸多態性（SNP）被發現與多種疾病密切相關。為了揭示這些SNP在病理過程中的具體作用，研究者越來越多地依賴於具有特定位點突變的細胞模型作為功能研究和機制探索的重要工具。儘管相關構建技術已經取得長足進展，但點突變模型的建立依然面臨效率不穩定、難度高等挑戰。為此，小編整合基因編輯領域多年技術積澱，推出四種主流解決方案，滿足多樣化科研需求。

一、RNP法：靈活高效的主流編輯方案

適用範圍：常見貼壁細胞、標準SNP替換建模

技術核心**：**

該方法將體外合成的gRNA與Cas9蛋白預先組裝為RNP複合物，並與單鏈寡核苷酸（ssODN）作為供體模板共轉染至目標細胞。Cas9在識別切割目標DNA後，細胞通過同源定向修復（HDR）機制引入指定鹼基變化。

操作流程概覽：

精準設計gRNA（靶點±20 bp）

合成帶突變信息的ssODN（長度約120–150nt）

共轉染RNP + ssODN（電轉或脂質體法）

PCR篩選 + Sanger測序確認

技術優勢：

不依賴DNA質粒，表達短暫，降低脱靶風險

操作流程簡潔，適應性強

成本相對較低，適合中高通量構建

潛在限制：

RNA本身不穩定，對實驗操作要求較高

需依賴高效gRNA設計，部分位點成功率受限

不適用於低HDR效率或難轉染細胞類型

二、Prime Editing：突破性精確編輯工具

適用範圍：複雜鹼基替換、小片段插入或缺失

技術原理：

Prime Editing採用融合了Cas9-nickase與逆轉錄酶的Prime Editor酶體系，並配合含有編輯模板的pegRNA。系統無需DNA雙鏈斷裂或供體DNA模板，即可將特定突變“寫入”基因組中。

操作流程概覽：

設計pegRNA（含引導區、RT模板與PBS）

質粒共轉染Prime Editor + pegRNA

選用適當轉染手段（如電轉、脂質體）

測序確認編輯成功

技術優勢：

可實現多類型點突變（包括非轉換類）

極低脱靶率，indel風險顯著下降

在突變功能驗證等高精度研究中優勢明顯

潛在限制：

pegRNA設計複雜，實驗優化週期長

整體編輯效率仍有提升空間

細胞系依賴性強，部分類型不適配

三、Base Editing：無需斷裂的高效鹼基替換工具

適用範圍：已知可轉換鹼基突變（C>T、A>G等）

技術原理Base Editor由特定脱氨酶（如APOBEC或TadA）與Cas9-nickase融合構成，在目標位點實現鹼基“轉化”而非“切換”，規避DNA雙鏈斷裂及HDR依賴。

CBE系統實現 C→T 或 G→A

ABE系統實現 A→G 或 T→C

操作流程概覽：

精準設計gRNA，使突變位於編輯窗口

轉染編輯系統（質粒或病毒載體）

PCR + 測序篩選陽性克隆

技術優勢：

效率極高，且細胞毒性較低

編輯安全性好，適合用於敏感突變研究

已在多種細胞與生物模型中驗證成熟

潛在限制：

僅適用於特定類型的鹼基轉換

編輯窗口有限，易出現“旁觀突變”

多個目標鹼基並存時難以精準控制

四、質粒抗性篩選法：解決複雜突變建模難題

適用範圍：特殊位點、低HDR細胞或gRNA難設計區域

技術原理：

通過共轉染表達Cas9/gRNA的質粒與帶有抗性篩選盒和長同源臂的供體質粒，利用HDR機制完成精準插入。篩選盒嵌於內含子區，由LoxP位點包裹，可後期通過Cre酶切除。

操作流程概覽：

設計內含子靶點gRNA與600–1000 bp同源臂

轉染Cas9/gRNA + Donor質粒

抗生素篩選陽性細胞，使用Cre去除抗性盒

PCR + 測序驗證

技術優勢：

篩選效率高，適用於HDR效率低的細胞系

不依賴PAM附近的精準設計，適配範圍廣

可用於構建複雜或低頻率點突變模型

潛在限制：

實驗週期較長，操作流程繁複

抗性盒移除後LoxP殘留，存在“編輯痕跡”

對不耐抗生素的細胞系不適用

總結

精準**點突變****細胞系**的構建策略因實驗目的、突變類型與細胞特性而異。RNP法因其簡潔與靈活性成為首選，Prime Editing與Base Editing則在精密控制與特定突變類型中展示強大潛力，而質粒抗性篩選則為複雜構建任務提供了強有力的支持。選擇合適方案，將顯著提升突變模型的構建效率與實驗可重複性。