(KO)敲除細胞系構建：從CRISPR/Cas9到高效編輯策略_風聞

2020年，諾貝爾化學獎授予了CRISPR/Cas9技術的兩位科學家，這項被稱為“基因剪刀”的技術，正在深刻改變基礎科研、疾病治療、農業育種等多個領域。它不僅實現了對DNA的精準修飾，還讓基因功能研究進入了高效、低成本的新階段。

在基因編輯不斷發展的今天，如何構建高質量的敲除（Knockout, KO）細胞系，成為研究人員突破課題瓶頸的關鍵。本文將全面梳理KO細胞系構建的技術原理、操作策略、常見應用以及面臨的挑戰，助力科研實踐更高效推進。

CRISPR/Cas9簡析：基因編輯的利器

1. 來源機制：源自細菌的天然“免疫系統”

CRISPR（成簇規律間隔短迴文重複序列）起初是細菌為抵禦病毒而進化出的適應性免疫機制。病毒DNA侵入後，細菌將其片段整合進自身基因組並形成“記憶”，未來再次遭遇同一病毒時，可通過crRNA引導Cas9蛋白精確識別並切割病毒基因。

這一天然機制被科學家轉化為強大的基因編輯工具。人工設計的sgRNA（單鏈嚮導RNA）可引導Cas9蛋白靶向並切斷任意基因，利用細胞的修復機制實現基因敲除或敲入。

2. 技術優勢：簡單高效，適用廣泛

操作簡便：只需設計一段20bp的sgRNA，即可實現精準定位目標基因；

適用多種物種：涵蓋人類、動植物、酵母等；

性價比高：相較ZFN和TALEN，成本大幅降低，門檻更低。

sgRNA的設計：精準編輯的關鍵第一步****1. 設計原則

優先選擇靠近ATG起始密碼子的外顯子區域；

迴避重複序列及GC含量極端區域，優化編輯效率；

對於存在多個轉錄本的基因，選擇保守外顯子區域；

避免選擇與其他基因有高同源性的區域，降低脱靶概率；

藉助在線工具預測gRNA效率與特異性，進行精篩。

2. gRNA數量選擇方案

單gRNA移碼敲除：適用範圍廣，操作簡便，但對非編碼區與短外顯子效果有限。

雙gRNA小片段敲除：可直接通過PCR長度差判斷編輯成功，準確率更高。

多gRNA大片段或全基因敲除：徹底破壞功能，但設計複雜，編輯效率受限。

敲除細胞系構建優化策略構建敲除細胞過程中常遇難點包括編輯效率不高、脱靶效應明顯、篩選週期長等。針對這些問題，以下策略可供參考：

**1.**基於算法的gRNA個性化設計：結合目標細胞基因組特徵進行多維度打分篩選。

**2.**不同細胞系參數調整：根據類型優化轉染方式、Cas9活性水平等關鍵條件。

**3.**Cell Pool編輯效率快速評估：通過高靈敏度檢測手段確認初步編輯效果。

**4.**提升克隆形成率：優化培養體系，提升單克隆擴增效率。

**5.**微量細胞高通量鑑定技術：大幅縮短篩選週期，提高陽性克隆篩查效率。

**敲除細胞的核心應用場景****1.**基礎科學研究

敲除關鍵基因（如TP53）研究其在癌症發生中的作用；

配合CRISPR文庫篩選，開展全基因組功能研究。

**2.**疾病模型構建

敲除APP等基因，建立神經退行性疾病模型；

利用患者來源的iPSC模擬遺傳病，為個性化醫療提供依據。

**3.**藥物靶點驗證與新藥篩選

敲除候選靶點，評估其對疾病相關通路的影響；

構建耐藥細胞模型，研究抗藥機制，助力藥物開發。

**4.**農業與生態研究

敲除作物感病基因，提升抗病能力；

用於環境保護相關的基因調控研究。

總結敲除細胞系作為揭示基因功能、驗證疾病機制和開發創新療法的重要手段，正藉助CRISPR等新興技術，邁向更高通量、更精準、更自動化的發展階段。掌握前沿策略與方法，將顯著提升科研效率，為生命科學探索提供堅實支撐。