【文獻解讀】CRISPR/Cas12a輔助開發新型單核苷酸突變檢測利器_風聞

單核苷酸變異（SNV）是基因變異的一種形式，與多種嚴重疾病的發生密切相關，如癌症、單基因遺傳病和傳染病。準確檢測SNV對於疾病診斷和精準醫療至關重要。然而傳統的 CRISPR-Cas12a SNVs檢測由於細微的自由能變化難以實現準確鑑定，特別是擺動鹼基對和高鳥嘌呤-胞嘧啶（GC）區域中的SNVs。

對此，來自湖南師範大學的研究人員創新性地開發了一種新型CRISPR-Cas12a系統——高能量懲罰單核苷酸變異檢測（HEPSD）平台。該平台通過引入非平衡雜交機制，顯著提升了CRISPR系統在檢測複雜單核苷酸變異（SNV）類型中的性能，為精準檢測和診斷相關疾病提供了新的技術手段。相關研究成果“Nonequilibrium hybridization-driven CRISPR/Cas adapter with extended energetic penalty for discrimination of single-nucleotide variants”近期發表在《Nucleic Acids Research》（IF:16.6）上。

文章亮點：

1、創新性開發了高能量懲罰SNV檢測（HEPSD）平台，通過非平衡雜交機制顯著增強了對單核苷酸變異（SNV）的檢測能力

2、HEPSD平台能夠有效區分高GC含量區域和擺動鹼基對等難以檢測的SNV，克服了傳統方法的侷限性

3、該平台能夠檢測到低至0.01%變異等位基因頻率的突變，展現出對低丰度突變的高靈敏度檢測能力

4、通過分子動力學模擬和熒光各向異性測量，揭示了HEPSD平台的非平衡雜交機制，為CRISPR系統的特異性調控提供了新的思路

一、HEPSD平台的設計

前人研究發現，傳統的CRISPR-Cas12a系統在識別錯配目標時，自由能變化（ΔG）較小，難以有效區分野生型和突變型序列。為了提高對SNV的檢測能力，需要設計一種能夠顯著增加錯配能量懲罰的系統。

研究人員為此設計了一種二元crRNA架構，通過非平衡雜交驅動的調控機制，放大了單核苷酸錯配的能量懲罰。這種設計稱為高能量懲罰 SNV 檢測（high-energetic-penalty SNV detection ，HEPSD）平台。它使得CRISPR/Cas12a系統在整個靶向區域內對基因組DNA中的突變表現出顯著的偏好，同時防止了由單個錯配核苷酸誘導的假激。

圖1. 設計圖示

二、平台性能驗證

1、熱力學分析

紫外熔解實驗結果顯示二元探針（binary probe，BPs）在25°C至50°C範圍內表現出穩定的雜交特性，而線性探針（linear probe，LPs）僅在高於68°C時才表現出顯著的雜交特性；圓二光譜分析觀察到BPs在匹配目標時表現出典型的RNA/DNA雙鏈特徵，而在錯配目標時信號顯著減弱。結果表明BPs在較寬的温度範圍內表現出穩定的雜交特性，且在識別錯配目標時表現出顯著的能量懲罰，增強了對SNV的區分能力。

圖2. LP和BP的鑑別表徵

2、熒光猝滅分析

熒光淬滅分析Cas12a與RNA（crRNA或BP輔助的crRNA）的結合過程顯示，傳統CRISPR-Cas12a系統的ΔG為0.55 kJ/mol，而HEPSD平台的ΔG增加到3.13 kJ/mol。結果表明HEPSD平台在識別錯配目標時表現出更高的能量障礙，顯著抑制了Cas12a的激活，提高了對SNV的識別能力。

圖3. 匹配或不匹配靶標的普通CRISPR/Cas12a系統與HEPSD之間的△G和△△G值的比較分析

3、分子動力學研究

為了瞭解HEPSD系統在識別匹配和不匹配目標時的雜交動力學，研究人員進行了分子動力學模擬研究。均方根偏差（RMSD）分析結果顯示，匹配目標的RMSD值在10 ns後穩定，而錯配目標的RMSD值持續波動。該結果説明了HEPSD平台在識別錯配目標時表現出動態不穩定性，而在匹配目標時則表現出穩定的結合，進一步證實了其高特異性檢測能力。

圖4. 匹配或不匹配靶標的CRISPR/Cas12a (C)和HEPSD (D)進行MDs模擬的RMSD分析

4、熒光各向異性測量

通過熒光各向異性測量研究HEPSD平台在識別匹配和錯配目標時的結合穩定性時發現，匹配目標的熒光各向異性值較高，而錯配目標的熒光各向異性值較低。結果説明HEPSD平台在識別錯配目標時表現出較低的熒光各向異性值，表明其結合較弱，進一步驗證了其高特異性。

圖5. HEPSD與匹配或不匹配的目標的結合穩定性FA分析

三、臨牀樣本檢測

研究人員使用HEPSD平台對收集的132個臨牀樣本（包括BRAF V600E和EGFR L858R突變）進行了檢測。結果顯示，在104個BRAF V600E樣本中，88個突變型樣本和16個野生型樣本的檢測結果與NGS結果高度一致；在20個EGFR L858R樣本中，11個突變型樣本和9個野生型樣本的檢測結果與NGS結果高度一致；在8個臨牀血漿樣本中，HEPSD平台檢測到的突變型樣本與NGS結果一致。這些結果證實了HEPSD平台能在臨牀樣本檢測中實現了100%的準確率。

圖6. BRAF V600E和EGFR L858R樣本的臨牀分析

綜上所述，研究人員巧妙地重新設計了CRISPR/Cas12a系統中的CRISPR RNA（crRNA）雜交區域，藉助非平衡雜交驅動機制，顯著提升了單核苷酸錯配的能量懲罰。基於此，他們成功開發出一種高能量懲罰單核苷酸變異檢測（HEPSD）平台，極大地增強了對單核苷酸變異（SNV）的檢測能力。該平台能夠將BRAF V600E和EGFR L858R這兩種腫瘤突變的變異等位基因頻率檢測至0.01%的水平，並且精準區分了132對臨牀樣本，充分展現了其在臨牀分子診斷領域的巨大應用潛力。

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