構建 CRISPR 敲除細胞系時要注意哪些步驟-源井生物_風聞

構建 **CRISPR 敲除細胞系**是一個包含多個關鍵環節的系統性工程。為了確保實驗的高效性與可靠性，每一個步驟都需要嚴格把控、精準執行。隨着 CRISPR 基因敲除技術在抗體驗證、功能基因組學、藥物靶點篩選等領域的廣泛應用，越來越多科研人員開始嘗試在本實驗室內自主構建穩定的敲除細胞系，並不斷優化流程以提高成功率。

在標準流程中，CRISPR 敲除細胞系的構建每一步都存在需特別注意的要點：

1. 項目設計與目標確認

明確敲除目的：根據功能研究需求確定是否需敲除整基因、關鍵外顯子或大片段區域。如要提高敲除成功率，可考慮雙gRNA策略，實現片段缺失。

靶點選擇：優先選取功能關鍵外顯子，並使用多種算法進行離靶評估，儘量降低脱靶風險。

2. gRNA設計與構建

多位點設計：推薦設計至少兩條靶向同一目標的gRNA，或用於片段敲除的雙gRNA，提升 KO 的效率與穩定性。

序列優化：gRNA序列需符合 PAM 要求（如 NGG），並結合 GC 含量、二級結構等進行優化。

3. 載體構建或 RNP 組裝

表達模式選擇：

質粒載體轉染：如常用 pX330/pX459 系統，可搭載 Cas9 + gRNA；適合效率較高的銀脂或脂質體轉染。

RNP 形式轉染：將 Cas9 蛋白和合成 gRNA 預組裝，減少脱靶，提高敲除效率，適合不喜歡質粒殘留的應用。

病毒載體轉導：適用於難轉染細胞系，如iPS/ES，會根據不同細胞特點選擇病毒或電轉等方式。

4. 轉染與細胞處理

轉染方法：依據細胞類型選擇電轉/脂質體/病毒三種方式之一。源井 CRISPRU™ 表明，針對300多種細胞類型都實施過參數優化。

增強編輯：

使用 Lipofectamine 3000、Neon 電轉設備等提高轉染效率。

為減少壓力，可選擇瞬時轉染方式，更快獲取編輯結果。

篩選策略：

如使用帶有抗性座標的載體（如 pX459 含嘌呤黴素抗性），可在轉染後進行藥篩提升敲除率。

同時可結合熒光標記，用 FACS 富集陽性細胞。

5. 單克隆分離

限稀稀釋法：將轉染後的細胞稀釋至單細胞接種到96孔板或使用FACS分選，生成單克隆。

克隆培養：細胞生成小羣后逐步擴增，注意恆温、無污染及代數記錄。

6. 篩選與驗證

基因水平驗證：

使用 PCR 擴增靶基因區域，結合 Sanger 測序或 TIDE／ICE 分析，判斷 INDEL 型及敲除類型（單等位、雙等位）。

檢查片段缺失或拼接區間是否如預期發生。

蛋白水平驗證：

通過Western blot、免疫熒光或 ELISA 等方法，確認蛋白表達消失。

7. 功能評估與應用

敲除細胞系可用於功能驗證，如細胞增殖、遷移、凋亡檢測、細胞週期分析等。

若僅單基因敲除未滿足需求，可進行多基因聯合敲除。

8. 數據分析與質量控制

編輯效率評估：在 CellPool層面進行測序評估，可將效率提高10–20倍。

脱靶評估：通過測序或其他手段監測潛在脱靶位點，保障結果特異性。

報告交付：源井提供含克隆鑑定結果、編輯率、脱靶篩查、Mycoplasma 檢測等詳細數據報告。

9. 時間與費用預估

根據源井實際經驗，單基因 KO 細胞系最快可在1~4周交付。

服務模式為“未成功不收費”，降低客户風險。

源井 CRISPRU™ 平台在 gRNA 設計、轉染優化、效率提升、驗證流程和數據服務等方面提供了系統化支持，有效提高基因敲除效率、可靠性和可重複性，助您節省在細胞構建和驗證環節所需的數月時間，讓您專注於數據分析與科研突破本身。