乾貨丨E0771細胞培養與基因編輯技巧指南_風聞

作為源自C57BL/6小鼠的經典乳腺癌模型，E0771細胞因其優異的免疫兼容性及對腫瘤免疫微環境的高度敏感性，已成為乳腺癌免疫治療、免疫檢查點抑制研究及基因編輯建模等熱門領域的核心工具。從CAR-T療法功能驗證到CRISPR高通量篩選平台的構建，E0771細胞始終是科研工作者手中值得信賴的“利器”，助力深入探索腫瘤與免疫的前沿交匯。本文將全面梳理E0771細胞的使用要點，分享一線科研人員總結的培養經驗與高效基因編輯技巧，助你高效推進實驗進程，輕鬆拿下科研關鍵環節。

細胞信息

細胞名稱：E0771（小鼠髓樣乳腺癌細胞）

細胞形態：呈上皮樣，貼壁細胞

細胞培養條件：90%DMEM+10%FBS

氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%

温度：37℃

換液頻次：2-3天/次細胞

傳代比例：1:2-1:4

細胞生長正常圖片：以貼壁形式生長，單層鋪展，通常呈多角形或梭形，細胞邊界清晰。

細胞生長狀態差圖片：細胞形態會發生改變，細胞變圓、漂浮增多；細胞出現空泡；細胞坍塌不立體，細胞出現老化。

細胞復甦

1)準備：取7mL完全培養基於離心管中備用

2)解凍：將細胞從乾冰裏取出，用鑷子夾住蓋子放入 37℃水浴中快速晃動（注意：水不能沒過蓋子），使其在1分鐘左右完全融化，直至冰塊融化至綠豆大小，停止水浴

3)離心：將解凍後的細胞懸液轉移至離心管中，1100rpm條件下離心4分鐘，棄去上清液

4)重懸與接種：用完全培養基重懸細胞，接種於合適大小的培養皿或培養瓶中

5)培養：將培養皿或培養瓶置於37℃培養箱中培養，24小時後觀察細胞狀態及貼壁情況

細胞傳代（以T25瓶為例）

1)當細胞匯合度達到80-90%時可進行傳代，傳代時在超淨台內棄去培養瓶裏的培養液，加入5mLPBS洗滌細胞1-2次

2)加入1mL胰酶，輕輕晃動瓶子並使胰酶完全浸過細胞，將培養瓶放入培養箱孵育 1-3分鐘，待在顯微鏡下觀察到大部分細胞變圓變亮，輕輕晃動培養瓶兩側有大部分細胞脱落時，立即終止消化

3)加入2倍胰酶體積即2mL完全培養基終止消化，然後轉移至15mL離心管中

4)1100 rpm 室温離心 4 分鐘，離心結束，棄去上清，加入完全培養基重懸細胞

5)細胞按照1:2-1:4比例傳代，傳代第二天觀察細胞狀態

細胞凍存

1)收集細胞：按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中

2)離心：1100rpm條件下離心4分鐘，去掉上清

3)重懸與凍存：用細胞凍存液重懸細胞，按每1mL凍存液含1×10^6個細胞/mL分配到凍存管中，標註好名稱、代數、日期等信息

4)降温與儲存：將凍存管置於程序降温盒中，-80℃冰箱中過夜後轉入液氮罐內保存

注意： 細胞速度較快，需合理控制傳代比例； 細胞換液時請先預熱培養基，防止細胞收縮；若細胞出現收縮現象，建議消化後進行1：1傳代即可

細胞狀態差如何調整

1.培養基和血清：確保使用正確的基礎培養基，儘可能使用優質胎牛血清或根據細胞狀態適當調整血清比例

2.細胞培養環境：確認培養温度、濕度、氣象條件是否正常

3.避免使用過期或長時間存放的培養基，新鮮配製的完全培養基建議在兩週內使用完畢

4.細胞傳代操作：細胞傳代時，注意消化時間和胰酶濃度，避免因消化時間過長或過短導致的細胞損傷

5.消化過度或培養基pH值異常：縮短消化時間和調整培養基地pH

6.細胞聚集成團：消化後輕柔吹打（使用槍頭反覆吹吸至單細胞懸液）；可嘗試用Accutase替代胰酶（温和解離細胞）

細胞老化如何調整

1.確認培養條件以及培養環境是否正確

2.避免胰酶消化過度：合適的胰酶濃度和消化時間，避免用力吹打，造成細胞損傷

3.增加血清濃度/選擇高質量胎牛血清

4.調整細胞密度：細胞密度過高會導致營養不足和代謝廢物積累，從而加速細胞老化，應將細胞密度控制在適宜範圍內

5.添加生長因子，可以促進細胞增殖和分化，有助於改善細胞老化狀態

6.換低代次細胞

7.通過挑選單克隆等方法，從老化的細胞羣體中篩選出具有生長優勢的單克隆細胞，進行純化培養

E0771細胞轉染時注意事項

1.確保細胞狀態良好，細胞處於對數生長期，此時細胞活性高，分裂旺盛，有利於轉染效率的提升，細胞密度一般在70-80%之間

2.注意細胞消化時間，避免過度消化，對細胞造成傷害

3.實驗過程中細胞要吹打成單細胞，避免細胞聚團

4.細胞進行實驗時活率≥80%

5.電轉法進行實驗時控制好電轉細胞量，電轉後接種到合適的培養板裏

6.用電轉法進行實驗時要保證電轉後細胞貼壁率≥70%

8.用電轉法轉染後細胞狀態可能會變差，此時可提高血清濃度對細胞進行培養

9.慢病毒法進行實驗時要控制好感染前的細胞匯合度30-40%之間，不可過高

10.選用病毒法進行正式實驗前可進行預實驗找到最合適的MOI;感染前添加助染劑 Polybrene

11.對於轉染試劑使用前需要充分混勻保證其均勻性

12.建議進行藥篩預實驗找到最佳藥篩濃度，以便於轉染後進行藥篩

E0771鋪單克隆實驗注意事項

1.確保鋪克隆實驗前細胞狀態正常，老化細胞少，建議控制細胞匯合度在70%左右

2.鋪克隆時細胞活率≥85%

3.可先進行預實驗找到合適的鋪克隆梯度，避免單克隆佔比太低

4.細胞接種96孔板時需確保細胞分佈均勻

5.稀釋細胞計數後結果最好落在1*10^6-2*10^6之間

慢病毒感染圖:

電轉法轉染圖片：