一文讀懂 KO Pool：高效細胞基因敲除的核心方法_風聞

一文讀懂 KO Pool：高效細胞基因敲除的核心方法

什麼是 KO Pool？

KO Pool 是一種在細胞羣體中批量敲除目標基因的策略，跳過了單克隆篩選環節，大幅簡化實驗流程，並顯著加快了功能驗證進度。

KO Pool 的主要優勢包括：

無需單克隆挑選，節省大量時間與資源

高效敲除目標基因，直接進行表型檢測

快速獲得生物學響應，適用於初篩和快速驗證

敲除效果穩定且徹底，在許多場景中優於RNAi干擾

KO Pool 技術的典型應用場景

高質量的KO Pool體系適用於多種生物醫學研究任務，尤其在以下領域表現突出：

1.****細胞增殖與存活評估快速判定基因敲除對細胞生長和代謝的影響。

2.****功能基因篩選與信號通路解析適用於高通量分析關鍵基因，識別潛在的致病因子或信號路徑。

3.****藥物靶點篩選與驗證通過基因敲除快速定位潛在靶標，輔助藥物開發與機制研究。

4.****疾病模型構建可在原代細胞或iPSC中敲除相關基因，用於模擬疾病狀態或表型。

5.****抗體驗證與蛋白功能研究用於明確目標蛋白的敲除效果，檢測抗體特異性及下游影響。

KO Pool 構建的高效解決方案

目前業內已有成熟的基因編輯平台專門用於高效構建KO Pool體系，其優化技術通常包括以下幾個方面：

1.靶向設計算法優化根據目標細胞的基因組結構和表達圖譜，設計高效打靶位點，提升敲除效率。

2.****雙gRNA協同編輯採用相鄰位點的雙gRNA配對，顯著增強雙鏈斷裂頻率，提高敲除完整性。

3.****標準化細胞編輯流程針對不同類型細胞系（包括難轉染細胞）建立優化流程和參數庫，提升成功率。

4.無偏差****檢測系統結合qPCR、NGS、質譜等方法，全面評估編輯效率和敲除結果。

5.****單細胞基因型識別技術適用於單克隆篩選或進一步功能驗證，確保數據可靠性。

圖1: 定製CRISPR-U™ KO pool的工作流程案例分析：PDXK基因在HepG2細胞中的敲除效果對比

在一項針對HepG2細胞系的研究中，科研團隊通過雙gRNA策略構建了PDXK基因的KO Pool，並與3株獨立的PDXK單克隆細胞進行了比較。

蛋白質組學分析結果顯示：

KO Pool樣本的重複性更好（標準差更小，見圖1A）

KO Pool識別出6種顯著下調蛋白，而單克隆僅發現4種

KO Pool表型更接近細胞羣體平均狀態，更適合用於早期篩選和系統分析

應用提示與注意事項

儘管KO Pool策略在短期功能研究中表現出色，但在需要長期穩定表達、研究突變背景或開展精細功能解析時，構建穩定的單克隆系仍是必要步驟。此外，為避免出現誤判敲除結果的情況，建議使用蛋白質組學手段確認是否存在截短蛋白或外顯子跳躍現象。

圖2: PDXK-KO細胞的蛋白質組學表型

小結：KO Pool 為RNAi提供更理想的替代方案

作為CRISPR技術的一種高效應用形式，KO Pool平台在高通量篩選、功能驗證和早期藥物研發中展現出卓越的效率與可擴展性。相比RNAi，KO Pool具有更強的穩定性與特異性，更符合現代功能基因組學的研究需求，是當前探索基因功能的理想解決方案。